Virus del HIV

Il virus è un Retrovirus rivestito con envelope, il quale presenta due glicoproteine di superficie, quali gp120 o SU (proteina di superficie), e gp41.
La gp120 rappresenta l’antirecettore virale. La gp41 è invece trans-membrana ed è dunque anche detta TM. Gp41 è normalmente nascosta dalla gp120 e si attiva solo dopo che è avvenuta l’interazione tra recettore e corecettore, e determina la fusione tra envelope e membrana citoplasmatica cellulare.
Al di sotto dell’envelope si trova la matrice costituita dalla proteina p17, la quale ha un ruolo molto importante nell’infezione, oltre a quello di stabilizzazione della particella virale. 

Poi si ha il capside a simmetria icosaedrica, a struttura toroidale (a tronco di cono) costituita dalla p24 (proteina capsidica codificata da GAG). All’interno è contenuto il genoma, due molecole di RNA a singolo filamento a polarità positiva associate a proteine nucleo-capsidiche e gli enzimi per la retro-trascrizione e l’integrazione.

Sul genoma vi sono i tre geni strutturali di tutti i retrovirus quali GAG-POL-ENV, oltre ai quali HIV presenta altri 6 geni regolatori che sono estremamente importanti e che costituiscono l’arma vincente di questo virus. Questi 6 geni sono TAT, REV, VIF, VPR, VPU (non esiste nel genoma di HIV-2 nel quale troviamo VPX) e NEF , sono tutti imbricati nella regione del genoma che codifica per ENV e vengono prodotti a seguito di processi di splicing diversi del trascritto primario di questa regione. POL codifica per trascrittasi inversa, integrasi e proteasi, GAG invece per la proteina della matrice p17, proteina capsidica p24 e proteine nucleocapsidiche.

Nel processo di trascrizione si formano vari tipi di mRNA, si forma un unico mRNA per GAG e POL, che viene dunque tradotto in una unica poliproteina GAG-POL, la quale è poi clivata dalla proteasi durante le fasi terminali del ciclo. Inoltre si può formare un mRNA solo di GAG, il quale è tradotto in una unica poliproteina che viene sempre tagliata dalla proteasi. Per quanto riguarda la trascrizione della regione ENV, a seconda appunto degli eventi di splicing che avvengono, si forma un mRNA unico tradotto in gp160, clivato poi in gp120 e gp41 (questo non ad opera della proteasi virali, ma ad opera di proteasi cellulari), invece lo splicing determina la formazione finale delle 6 proteine regolatorie.
Di queste sei proteine regolatorie, una è estremamente importante ed è TAT, la proteina trans-attivante. Questa è tanto importante che è l’antigene costitutivo di una serie di vaccini a più avanzato stadio di sperimentazione messi a punto dalle ultime terapie sperimentali.

TAT è così importante perché è un trans-attivatore sia della trascrizione virale che cellulare. Come attivatore della trascrizione virale è molto più potente delle LTR (long terminal repeat): le LTR sono dei potenti attivatori della trascrizione virale in proto-oncogeni cellulari quando l’integrazione del genoma virale avviene vicino ad essi, TAT supplisce dunque alle funzioni di LTR in HIV, ed è decisamente più potente delle LTR. Bloccare TAT significa dunque inficiare ed inibire decisamente la replicazione virale.

TAT promuove anche la trascrizione di diversi geni cellulari, allo scopo di rendere le cellule un ambiente idoneo alla replicazione virale, prepara dunque la cellula alla replicazione virale, riesce a far si che vengano attivati geni in modo da inattivare il blocco alla trascrizione e replicazione virale. Questo, TAT lo fa non solo sulla cellula infettata, ovvero che esprime la proteina TAT del virus, ma agisce anche su cellule sane, in quanto si attiva un loop autocrino e paracrino, TAT viene infatti secreto e raggiunge cellule non ancora infettate promuovendone la trascrizione e rendendole particolarmente suscettibili all’infezione.

Anche questo è un aspetto importante, in quanto se si riuscisse a bloccare questo passaggio ovviamente le cellule non ancora infettate diventerebbero meno sensibili all’infezione e contribuirebbero dunque a controllare l’infezione. Il fatto che TAT venga secreto implica che possa essere bloccato dalla risposta immunitaria e dunque bloccato dagli anticorpi, e dalla risposta cellulo mediata. Per di più TAT rispetto ad altre proteine virali è estremamente conservata, ha una variabilità molto inferiore rispetto ad altri antigeni virali. Per esempio ENV, essendo una proteina superficiale, è sottoposta ad una intensa risposta anticorpale da parte dell’organismo, subisce uno stress tale da rendere necessaria una elevata variabilità, viceversa TAT, considerando le funzioni essenziali che svolge non può essere suscettibile di un alto tasso di mutazioni in quanto altrimenti perdebbe il suo ruolo. Essendo una proteina conservata rappresenta un ottimo bersaglio per un eventuale vaccino, uno dei motivi per cui non esiste un vaccino per HIV è proprio questo, per la notevole variabilità dei vari antigeni che sono stati utilizzati come target della terapia. Un altro aspetto importante di TAT è che downregola l’espressione delle molecole MHC di classe I, in questo modo favorisce la fuga del virus dal sistema immunitario, meno antigeni virali verranno esposti e la presenza del virus nell’organismo risulterà essere più efficacemente celata.
È inoltre una importante proteina apoptogena che contribuisce al calo del CD4, viene secreto e induce apoptosi anche in cellule non ancora infettate.

Un altro aspetto importante è la modificazione dell’espressione dei corecettori sulle cellule. Per effetto di TAT viene down regolata l’espressione del corecettore CXCR4 (utilizzato dal ceppo linfotropico per infettare i linfociti), mentre viene upregolata quella di CCR5 (utilizzato per l’infezione dei macrofagi). TAT contribuisce nell’individuo infettato alla selezione di ceppi M-tropici (infezione dei macrofagi) dando ad HIV un notevole vantaggio.
TAT è anche coinvolto nella insorgenza del Sarcoma di Kaposi, attiva la risposta di citochine pro infiammatorie, favorisce l’azione trasformante angiogenetica di HHV8 (agente eziologico del Sarcoma di Kaposi).

Per quanto riguarda REV, è una proteina regolatoria estremamente importante. Anche questa è una proteina che favorisce il ciclo replicativo virale in modo importante, perché inibisce lo splicing degli mRNA di ENV e favorisce la traslocazione dal nucleo al citoplasma dei grossi mRNA virali (GAG POL o lo stesso ENV), forza dunque la cellula a tradurre certi messaggeri virali piuttosto che altri.

 

HIV è caratterizzato da un’enorme variabilità e dunque se ne possono identificare diversi tipi, sottotipi e sottoclassi che sono raggruppabili in 3 diverse categorie:

  • M o Major, a sua volta suddiviso in 11 sottotipi indicati con le lettere che hanno una diversa localizzazione geografica.
  • I due gruppi N ed O sono invece decisamente meno diffusi e sono ceppi localizzati soprattutto al nord.

Quello che interessa maggiormente è il HIV del gruppo M sottotipo B diffuso in Europa, nelle Americhe e in Oceania. In Africa e in estremo Oriente prevalgono altri sottotipi come A e C. Oltre ai sottotipi classici ci sono dei ricombinanti (c’è una variabilità enorme) che si formano in quanto non c’è il fenomeno della inibizione della superinfezione, ovvero un individuo infettato con un determinato tipo di HIV può essere tranquillamente superinfettato o coinfettato da un altro tipo di virus, e qui possono avvenire fenomeni di ricombinazione.
Quest’aspetto è importante in quanto non tutti i kit diagnostici riconoscono tutti i tipi ed i sottotipi di HIV, quindi i prodotti che le industrie farmaceutiche hanno realizzato per i paesi industrializzati possono ad esempio non funzionare nei paesi in via di sviluppo o da noi se ci sono dei pazienti che hanno contratto l’infezione in altre regioni.

 

Elevata variabilità di HIV: il virus presenta una mutazione ogni 103/104 nucelotidi, mediamente 1 o 10 nucleotidi mutati per ogni nuovo genoma, dovuta alla mancanza della attività di proofreading della trascrittasi inversa, ed il fatto che compia dei salti.
Questo ha delle conseguenze decisamente importanti: da una parte la fuga dal sistema immunitario che non è in grado di sconfiggere l’infezione, dall’altra la possibilità di formazione di stipiti farmaco-resistenti.

HIV ha inoltre un’enorme quantità di armi a disposizione, wuesto è da tenere presente nella scelta dei farmaci. I farmaci che inibiscono l’interazione virus-recettore/corecettore, possono facilmente portare a selezionare dei ceppi che utilizzano dei recettori diversi, con un tropismo ed un significato clinico diverso.

 

MECCANISMI PATOGENETICI

La via di ingresso principale di HIV è rappresentata dalla mucosa genitale, la quasi totalità delle infezioni avviene per un rapporto sessuale. Cosa avviene nella sede di ingresso? La popolazione cellulare più importante è quella delle cellule dendritiche, la presenza in questa sede di lesioni e di processi infiammatori favorisce notevolmente l’impiantarsi dell’infezione, in quanto in questo caso HIV trova subito le cellule di cui ha bisogno, ovvero le cellule infiammatorie.
Si tratta in gran parte di rapporti sessuali traumatici che comportano delle microlesioni, un altro fattore favorente sono poi naturalmente le lesioni luetiche da sifilide, così come tutte le altre malattie a trasmissione sessuale. La loro incidenza è particolarmente aumentata negli ultimi decenni, sono moltissimi i casi di infezione da sifilide. La lesione luetica proprio per l’infiltrato infiammatorio da cui è caratterizzata rappresenta una comune porta d’ingresso di HIV.

In questa sede vengono infettate le cellule dendritiche che hanno bassissimi livelli di CD4, sono cellule scarsamente sensibili alla infezione da HIV, o comunque meno sensibili rispetto alle altre cellule. Il virus entrando in queste cellule riesce a passare ai linfociti CD4 grazie a molecole espresse da queste stesse cellule, che sono molecole di tipo ICAM-3 e questo determina la fusione delle cellule denditriche con i linfociti, si ha quindi il passaggio nei linfociti CD4 in cui la replicazione virale è molto efficace.

Si producono grossi quantitativi di virus. Le cellule dendritiche migrano poi alle stazioni linfonodali più vicine dove l’infezione è estesa e trasmessa ad altri linfociti CD4, comincia dunque quel circolo vizioso che è l’arma più forte del virus. HIV ha numerosi meccanismi patogenetici e molti di questi hanno lo scopo di mantenere costantemente attivato il sistema immunitario in modo tale da avere una produzione costante di CD4 nuovi in modo da avere sempre nuovi bersagli. Lo scopo dell’infezione è avere sempre nuove cellule da infettare per il virus.
A livello dei linfonodi i CD4 vengono distrutti dalla replicazione virale, questo è uno stimolo alla produzione di nuovi CD4 e porta all’espansione della infezione. Nel giro di una settimana/10 giorni la stragrande maggioranza dei CD4 dell’organismo è infettato da HIV, si ha il picco viremico caratteristico della infezione primaria.

 

VARI MECCANISMI CON CUI IL VIRUS SFUGGE AL SISTEMA IMMUNITARIO

Il virus riesce a sfuggire al sistema immunitario grazie alla grande variabilità dei suoi antigeni di superficie in quanto il suo genoma è sottoposto a eventi ricombinatori importanti. L’alto tasso di mutazioni fa sì che i bersagli della risposta immunitaria, in particolare ENV, si modifichino continuamente e si formino gli Escape Mutants, ovvero quelle cellule mutate che riescono a sfuggire alla risposta immunitaria, mutanti silenti che non vengono visti dal sistema immunitario, e quindi questi mantengono l’infezione. Il sistema immunitario risponde anche nei confronti di questi mutanti, ma nel frattempo il virus ha mutato di nuovo, si crea una rincorsa tra il sistema immunitario e il virus nella quale vince nettamente il virus, che riesce a mutare molto più velocemente di quanto la risposta immunitaria riesca ad adattarsi ai mutanti (anche i virus dell’epatite B riescono a dare una cronicizzazione grazie alla loro notevole variabilità). Questo è forse il meccanismo più importante, ma ce ne sono anche altri.
Esistono moltre altre strategie adottate dal virus, ad esempio TAT, che inibisce l’espressione dell’MHC di classe I, un effetto provocato anche da altre proteine virali regolatorie, come NEF o VPU, che contribuiscono a downregolare le molecole MHC e quindi le cellule non espongono antigeni e peptidi virali in modo efficace.

Inoltre, la latenza clinica non è una vera latenza, in quanto il virus continua a replicarsi nei linfociti e nei macrofagi, oltre a ciò c’è tuttavia una percentuale molto bassa ma comunque importante di linfociti T quiescenti (non attivati) in cui il virus c’è in forma latente, cioè si ha una vera e propria latenza virologica, c’è il cDNA virale integrato, però questo non viene trascritto.
In questo caso in cui si riscontra la presenza del RNA virale integrato che tuttavia non viene trascritto, il virus è completamente inattivo e non produce niente. Questo significa

1) che sfugge al sistema immunitario

2) rappresenta un reservoir per la ripresa della replicazione virale

Queste sono quelle cellule a cui probabilmente è legato il fatto che la terapia non riesce a eradicare l’infezione. Le terapie antivirali infatti, compresi i farmaci antiretrovirali, agiscono solo su virus in attiva replicazione perché bloccano ad esempio una qualche attività metabolica, un enzima, un processo che avviene all’interno della cellula infettata. In queste cellule tuttavia il virus è quiescente e non produce nessuno dei bersagli della terapia antivirale, che non ha dunque alcuna attività su queste cellule. Nonostante si abbiano dunque risultati positivi sulla riduzione della viremia, in circolo rimangono queste cellule dalle quali può ripartire la replicazione virale.

Questo aspetto, per quanto numericamente limitato, contribuisce dunque sostanzialmente alla fuga dal sistema immunitario.

 

 

RUOLO DELLA PROTEINA P17

È una proteina della matrice virale, nei virus con l’envelope la matrice è sempre la componente più abbondante. È quindi una proteina particolarmente abbondante e particolarmente importante. Nel ciclo replicativo di HIV, P17 favorisce la replicazione del virus in due momenti distinti, cioè sia nelle fasi inziali che in quelle terminali della replicazione.

Nelle fasi iniziali è uno dei componenti più importanti del complesso di pre-integrazione, che è indicato appunto con l’acronimo PIC, è un complesso che si forma e permette al cDNA (ovvero il DNA che è stato retrotrascritto) di entrare nel nucleo e quindi di potersi integrare. HIV è l’unico retrovirus in grado di integrarsi in cellule quiescenti, cioè cellule non in attiva replicazione, proprio grazie a questo apparato di preintegrazione che consente al cDNA di passare attraverso i pori nucleari e dunque di infettare cellule in cui non c’è stata la disgregazione della membrana nucleare per effetto della mitosi. Tutti gli altri retrovirus possono integrarsi solo nel momento in cui la cellula si replica, ovvero nel momento in cui la membrana nucleare viene a mancare.

Questo complesso di preintegrazione è costituito dalla P17, dal cDNA virale, dall’integrasi, dalla retrotrascrittasi e da un’altra proteina virale, BPR. Tutto questo complesso in cui è presente anche P17 favorisce il passaggio attraverso i pori nucleari e consente al cDNA di andarsi ad integrare nel nucleo della cellula. Tuttavia come tutte le proteine della matrice P17 è anche importante nelle fasi terminali del ciclo replicativo.
Le proteine della matrice sono quelle che fanno da ponte tra le proteine dell’envelope e le proteine capsidiche attivando il processo di gemmazione e quindi di fuoriuscita del virus. Nella fuoriuscita di HIV è importante la poliproteina GAG-POL. La fuoriuscita inizia prima ancora che ci sia stato il taglio, ed è proprio l’estremo della poliproteina GAG-POL che diventerà poi P17, che va ad interagire con le proteine dell’envelope iniziando il processo di gemmazione, di fuoriuscita. La p17 nella fase finale fa da ponte tra le proteine dell’envelope (GAG-POL) e il genoma virale a RNA, dando inizio alla gemmazione.

Oltre a questa attività sul virus, in queste tappe del ciclo replicativo, p17 ha anche degli importanti effetti sull’organismo ospite, a livello del quale si comporta come una citochina proinfiammatoria, si parla dunque di virochina. Innanzitutto determina un aumento della replicazione e della espansione dei linfociti T e delle cellule NK, è dunque un altro di quei fattori che contribuisce a mantenere costituitivamente attivato il sistema immunitario. Inoltre potenzia la secrezione di altre citochine proinfiammatorie come IL2, IL10, IL12 e TNF-α, responsabili di questo stato infiammatorio protratto, e non solo ne potenzia la secrezione ma anche gli effetti, le cellule rispondono a queste citochine pro-infiammatorie in maniera decisamente più marcata grazie alla presenza della P17. Viceversa, si ha una azione di contrasto nei confronti delle citochine anti-infiammatorie.

Un aspetto patogenetico importante della p17, che dimostra come sicuramente abbia un ruolo molto importante, e solo parzialmente conosciuto, nella progressione della malattia, è il fatto che tale proteina venga secreta dalle cellule infettate, non si ritrova dunque solo all’interno delle cellule infettate. Una volta secreta si accumula nei linfonodi dove contribuisce a mantenere questo ruolo pro-infiammatorio. Una cosa significativa è che la proteina p17 si ritrova nei linfonodi anche in pazienti che da molti anni sono sotto terapia HAART e rispondono alla terapia, quindi i pazienti che sono anni che hanno una carica virale azzerata continuano ad avere livelli significativi di p17 nei linfonodi.

DEPLEZIONE DEI LINFOCITI CD4

Il calo dei CD4 avviene attraverso diversi meccanismi. Ci sono dei meccanismi diretti, in quanto la replicazione del virus nel linfocita è fortemente citocida, sia per il blocco o lo shift delle sintesi delle proteine cellulari verso i prodotti virali, sia per i danni che la gemmazione virale provoca sulla membrana citoplasmatica.
La formazione di sincizi, i ceppi sinciziogeni T tropici sono molto più aggressivi e patogeni in quanto la presenza del sincizio comporta una deplezione importante di linfociti, dato che una singola cellula infettata tramite i sincizi può arrivare a legare fino a decine o centinaia di cellule anche non ancora infettate, che vengono eliminate tramite questa modalità.

I CD4 calano non solo perché essi stessi vengono distrutti, ma perché a livello midollare vengono distrutti i precursori dei linfociti CD4, viene dunque a mancare un adeguato numero di cellule in maturazione. L’infiammazione cronica contribuisce poi a danneggiare fortemente lo stroma cellulare e l’ambiente a livello del midollo, che consente il corretto funzionamento del midollo. Questo danno si esercita poi su tutte le linee midollari e non solo quella linfocitaria.

Ci sono anche tutti i meccanismi indiretti di danno, innanzitutto c’è la distruzione, la lisi dei CD4 ad opera dei CD8, ma anche ad opera delle NK tramite il processo di ADCC (Antibody Dependent Cell Mediated Citotoxicity, o uccisione della cellula previo il riconoscimento dell’anticorpo o del complemento). Esistono poi vari prodotti virali come la gp120, la TAT, la gp41 e la p24, che sono tutte proteine tossiche (soprattutto a livello del sistema nervoso centrale) che vengono secrete dalle cellule infettate e vanno a danneggiare le altre cellule circostanti). Un altro aspetto importante è l’apoptosi, in quanto molti prodotti virali sono in grado di indurre apoptosi e le cellule vengono eliminate anche se non infette. Vengono anche prodotti autoanticorpi e ci sono numerosi prodotti virali che hanno porzioni della molecola di notevole affinità con normali strutture cellulari, e quindi anticorpi normali contro questi epitopi virali riconoscono anche strutture cellulari self che vengono aggredite e distrutte.