Trasformazione batterica

La trasformazione batterica è il meccanismo di ricombinazione genica il cui meccanismo è stato spiegato da Griffith nel 1928 con un esperimento sui topi.

In questo esperimento si è visto che inoculando per via endoperitoneale una sospensione di batteri virulenti vivi incapsulati, il topino muore nel giro di 24 ore per setticemia (è detta anche sepsi), e possono essere estratti dal sangue degli pneumococchi capsulati, questo perché la fagocitosi era impedita dalla presenza della capsula (lo vediamo nella fase “a”). Inoculando invece nel topolino delle colonie acapsulate, e quindi rugose, la cavia non riporta problemi (lo vediamo nella fase “b”), è stato successivamente dimostrato che i batteri acapsulati portano alla morte del topolino solo se sono presenti in grande abbondanza, in concentrazioni altissime, ad esempio se sono concentrati a 108. Questo è un esempio di retromutazione, in quanto qualche ceppo mutante retromuta, cioè è in grado così di ricostituire la capsula batterica, che è il fattore di virulenza più importante per questi batteri, in questo caso il topino muore, ma sono necessarie più di 24 ore affinché il ceppo retromutato possa effettivamente retromutare e poi possa riprodursi. Griffith prese inoltre dei batteri morti capsulati uccisi con il calore (per conservare l’acido nucleico integro) e li mischiò con dei batteri vivi acapsulati, ne risultò poi con un’inoculazione successiva di questi batteri che il mio topino utilizzato come cavia moriva (lo possiamo vedere nelle fasi “c” e “d”), nel sangue infatti risultavano essere presenti dei batteri capsulati, si è ipotizzato quindi un evento trasformante che andasse a costruire la capsula anche nei batteri che inizialmente ne erano sprovvisti. Griffith pensò inizialmente ad una semplice contaminazione da contatto tra i due diversi tipi di batteri, mentre venne evidenziato nel 1944 che questo accadeva per una ricombinazione genica, ovvero per una nuova acquisizione di materiale genetico. Questo esperimento è stato fondamentale sia perché ci ha fatto capire che l’acido nucleico è la molecola che raccoglie il patrimonio genetico della cellula, sia perché ha dimostrato che la capsula batterica è determinante come componente di patogenicità, in quanto impedisce la fagocitosi.

La trasformazione può essere considerata in due modi diversi, a seconda che si parli dei batteri Gram+ o dei batteri Gram-, questo perché le differenti strutture delle due pareti batteriche vanno a condizionare anche il meccanismo di ricombinazione genetica, infatti prenderemo come modello per i batteri Gram+ lo Streptococcus pneumoniae, mentre per i batteri Gram- consideriamo l’Haemophilus influenzae.

Se apriamo una piccola parentesi sull’esperimento del tubo a U, possiamo dire che questo esperimento vuole dimostrare che non è necessario un contatto tra due specie batteriche per far sì che avvenga una ricombinazione genetica. In questo tubo a U vengono messi da una parte una coltura batterica di un tipo, mentre dall’altra parte viene messa una coltura differente, e queste colture sono divise da un setto separatore che impedisce il passaggio dei batteri. Si nota che c’è comunque una ricombinazione tra le due specie, questo è un segno evidente del fatto che è presente qualcosa di più piccolo dei batteri, che riesce a passare attraverso il setto separatore, definito come un fattore trasformante, che è rappresentato dall’acido nucleico. Questo processo viene però bloccato se introduciamo nelle due colture una DNAsi, in quanto quest’enzima distrugge prontamente i frammenti di DNA non contenuti nelle cellule.

Lo Streptococcus pneumoniae (è un batterio Gram+)

Immaginiamo che ci sia un acido nucleico nell’ambiente, esso per essere trasformante deve avere alcune caratteristiche:

– deve avere un peso molecolare elevato, di almeno 106 Dalton

– deve essere a doppia elica

La cellula recettrice, per poter acquisire l’acido nucleico e ricombinarsi, deve trovarsi in uno stato particolare definito ‘stato di competenza’. Questo stato di competenza è dettato dalla natura stessa del batterio, in quanto nel cromosoma batterico è presente un gene che, raggiunta la fase di crescita stazionaria della cellula, induce la produzione di un fattore di competenza, quest’ultimo porterà le seguenti modificazioni nella cellula:

– espone una decina di proteine sulla superficie batterica, di cui una legante il DNA, una che arrangia il DNA in modo che sia idoneo ad essere trasportato nella cellula, una proteina carrier che lo trasporta all’interno della cellula e lo protegge dall’azione delle nucleasi (in quanto è diventato ora un filamento a singola elica, quindi è suscettibile all’azione delle nucleasi)

– regola la permeabilità all’interno della cellula batterica

A questo punto l’acido nucleico arriva nelle vicinanze del DNA endogeno batterico, dove avviene un meccanismo di sostituzione, ovvero un frammento di DNA endogeno viene sostituito con il DNA trasformante in specifici punti di omologia tra queste due sequenze di acido nucleico. Se il frammento è esattamente omologo (ovvero identico) non si verificano dei cambiamenti nella cellula batterica, ma se il filamento esogeno non è completamente omologo, si forma un “loop” e le endonucleasi, riconoscendo il ‘tentativo fallito’ di questo filamento esogeno, riportano il DNA endogeno nella sua posizione originale.

Quando può avvenire quindi questa trasformazione con un frammento di DNA non omologo?

Il requisito fondamentale è che siano presenti le due eliche separate, quindi può avvenire durante la replicazione batterica, quando le due eliche non sono accoppiate (le endonucleasi in questa maniera non sono in grado di recepire il segnale come lo abbiamo visto in precedenza). Nelle due cellule figlie avremo dunque una differenza, in una infatti si replicherà il DNA parentale, nell’altra invece saranno presenti i geni portati dall’esterno attraverso il meccanismo di trasformazione.

L’Haemophilus influenzae (è un batterio Gram-)

In questi batteri invece non esiste un gene che codifica per il fattore di competenza, quest’ultimo viene infatti indotto nella cellula mediante una coltura, in un terreno ricco di metaboliti, è quindi uno stato artificioso. Un’altra differenza di questi batteri rispetto a quelli visti in precedenza risiede nel fatto che negli pneumococchi, qualsiasi tipo di acido nucleico può essere recepito dalla proteina legante, non esiste una qualsiasi specificità, mentre negli Haemophilus influenzae avviene una selezione accurata di questi acidi nucleici.

Andando ad osservare al microscopio il Haemophilus influenzae, si osserva che non c’è una proteina carrier, o una proteina che lega il DNA, ma si formano delle protrusioni, delle vescicole che si espongono all’esterno della cellula e si chiamano trasformasomi. Essi hanno la caratteristica di avere un polo su cui è situata una nucleasi che riconosce una sequenza di 11 basi azotate a doppia elica, e solo l’acido nucleico che contiene questa sequenza viene captato dal trasformasoma (questa è comunque una sequenza facilmente reperibile, che si trova soprattutto nell’Haemophilus influenzae, questa sua preferenziale localizzazione però ne limita i salti evolutivi, non potendo questo batterio incrociarsi così con altre specie).

Abbiamo visto così che molti batteri sono in grado di trasformarsi naturalmente, mentre altri invece si trasformano in maniera artificiale, questi ultimi si mettono cioè in uno stato di competenza in modo artificiale, senza sfruttare le modificazioni indotte dal fattore di competenza (ad esempio ponendo una cellula batterica in un terreno di coltura ricco di ioni calcio, e sottoponendola a degli shock termici per crearne una permeabilità di membrana, si aggiunge l’agente trasformante che è solitamente un plasmide e degli enzimi di restrizione che servono per adattare il mio plasmide appena inserito nel terreno di coltura con il DNA batterico, così riesco ad operare una trasformazione artificiale).

Guardiamo ora un riepilogo sugli antibiotici ed i loro target

  • Gli antibiotici che agiscono sulla sintesi della parete batterica sono diversi, tra cui possiamo citare la cicloserina, la vancomicina, la bacitracina (che si usa in laboratorio per distinguere lo Streptococcus pyogenes, in quanto è l’unico tra gli streptococchi ad essere sensibile a questo antibiotico), la penicillina, la cefalosporina ed altri ancora
  • Sulla membrana citoplasmatica possono agire come antibiotici le polimixine, che agiscono come detergenti cationici, in quanto idrolizzano i fosfolipidi di membrana e fanno fuoriuscire il materiale intra-citoplasmatico dalla cellula batterica
  • Sui ribosomi 50S troviamo le eritromicine, le lincomicine, le clindamicine ed altri ancora, mentre sui ribosomi 30S troviamo degli antibiotici molto conosciuti come le tetracicline, le spectinomicine, le streptomicine, le tobramicine e le gentamicine (a parte le tetracicline, questi antibiotici fanno tutti parte della famiglia degli ammino-glicosidi). Il batterio può diventare resistente a queste sostanze costruendo degli enzimi che degradano la molecola dell’antibiotico, come succede nel caso delle penicilline

Ora vediamo qui a fianco le modalità con cui un batterio può diventare resistente ad un antibiotico (il PBP indica il Penicillin Binding Proteins).