Trasduzione batterica

Il secondo meccanismo di ricombinazione genetica è la trasduzione, essa ha la particolarità di non sfruttare il contatto fisico tra due cellule, bensì usa come veicolo di trasporto dell’acido nucleico un virus specifico, chiamato batteriofago. Essi sono dei virus particolari che attaccano specificatamente i batteri, questi ultimi fungono, quindi, da ‘officine metaboliche’, sono perciò indispensabili per la replicazione del virus stesso. I batteriofagi sono degli organismi “parassiti obbligati”, perché sono costituiti esclusivamente da un contenitore chiamato capside che protegge l’acido nucleico (che può essere RNA oppure DNA), ovvero il messaggio che ogni singolo virus veicola nella cellula ospite. Questo virus aggredisce una cellula, sfrutta tutte le sue capacità metaboliche e la indirizza verso la produzione di altri virus (come se modificasse tutti i circuiti di una fabbrica per far produrre delle cose diverse). L’attacco alla cellula batterica da parte del virus porta all’eliminazione del batterio stesso, come si può notare osservando i molti fori presenti su un terreno di coltura batterico contaminato dai batteriofagi.

Esistono diversi tipi di batteriofago, ma senza dubbio il più complesso ed il più completo è il fago l (lambda): esso presenta una testa, una coda contrattile, una piastra basale e delle fibrille che servono per appoggiare il batteriofago alla superficie solida della cellula, probabilmente anche per la produzione di sostanze che rendono più facile la penetrazione dell’acido nucleico (qualcosa di simile al lisozima) nella cellula batterica. Il fago l è addirittura più complesso dei virus dotati solo di un capside e della testa, che colpiscono le cellule animali, gli altri tipi di batteriofagi possono presentare invece delle variazioni strutturali, come ad esempio una coda più corta, oppure una coda non contrattile, possono esserci dei batteriofagi lineari e con altre caratteristiche peculiari ancora. L’iniezione dell’acido nucleico attraverso la parete batterica, e quindi nel citoplasma, avviene per la compressione della coda (analizzando la membrana batterica si notano dei tunnel che permettono il trasferimento degli acidi nucleici proprio grazie a questa compressione che avviene sul batteriofago), vediamo ora come avviene questo meccanismo.

Intanto distinguiamo due tipi di batteriofagi a seconda della loro natura, si parla in particolare di batteriofagi virulenti e di batteriofagi temperati. Il primo tipo di batteriofagi è particolarmente aggressivo e porta rapidamente ad un ciclo litico (che prevede la moltiplicazione istantanea delle particelle virali) nella cellula infettata. I batteriofagi temperati, invece, danno vita ad un ciclo lisogenico, non portano quindi immediatamente all’uccisione ed alla lisi della cellula infettata, ma permettono l’insorgenza di un intervallo (prolungato anche per diverse generazioni) in cui si verifica un rapporto stretto tra l’acido nucleico del virus penetrato ed il cromosoma del batterio, in pratica l’acido nucleico virale si va ad integrare sul cromosoma batterico in punti di omologia ben precisi, questo fenomeno si chiama lisogenia. E’ bene ricordare che anche questi virus prima o poi genereranno comunque un ciclo litico, ma ciò non avviene immediatamente. I batteriofagi virulenti danno vita ad una trasduzione generalizzata, i batteriofagi temperati danno vita invece ad una trasduzione che è definita specializzata. L’inizio di questo processo, ovvero l’inoculazione dell’acido nucleico da parte del virus all’interno della cellula batterica, è comune a tutte e due le nature di batteriofago, mentre le fasi successive sono differenti.

La trasduzione generalizzata

Nel batteriofago virulento, l’acido nucleico (quello pronto e disponibile per dare origine alla sintesi proteica) corrispondente va a posizionarsi sui ribosomi, bloccando la sintesi proteica cellulare e indirizzando tutta l’energia metabolica per la riproduzione delle particelle virali. Da una parte verrà predisposta la produzione dei capsidi proteici, mentre dall’altra parte, usando come stampo il DNA parentale, viene costituita una lunga elica non spezzettata, che contiene circa 100 ripetizioni del DNA parentale stesso (che viene definito concatamero, che a sua volta rimane unito con altre copie del DNA in maniera concatenata, per questo si parla della formazione di una serie di concatameri). Questo messaggio dovrà essere poi internalizzato nel capside altrove prodotto (attraverso un meccanismo di assemblaggio), e questo è il punto della trasduzione più suscettibile ad errori. La teoria più accreditata prevede l’esistenza di una nucleasi batterica che è in grado di riconoscere una sequenza di 11 basi azotate consecutive all’interno di questi concatameri. Alla fine di queste 11 basi azotate, la nucleasi taglia la sequenza in un sito chiamato Pack (da “packaging”), da questo punto si iniziano a riempire i capsidi e si procede finché non sono stati tutti riempiti. Essi vengono riempiti con tutto il materiale genetico possibile, infatti a volte si riscontrano delle situazioni in cui l’acido nucleico rappresenta il 103 % del totale (siamo in presenza dunque di un acido nucleico ridondante, che viene introdotto dunque in misura maggiore rispetto al DNA virale precedente). Quando quest’ultimo passaggio è completo, i batteriofagi lisano la cellula ospite per poterne fuoriuscire, e vanno ad infettare ognuno un’altra cellula batterica. Dopo pochissimo tempo si sono riprodotti di cento volte, e vanno ad infettare ancora altri batteri, creando un meccanismo che si trasmette a macchia d’olio, a cascata, si viene così a formare a partire da un terreno di coltura torbido, a contatto con dei batteriofagi, un terreno di coltura trasparente dopo pochi minuti perché le cellule batteriche sono tutte quante morte, lisate dai nostri batteriofagi. L’errore più comune che può avvenire in questo processo (già citato in precedenza) avviene quando viene riconosciuta questa sequenza di 11 basi sul cromosoma batterico e non sulle copie di quello virale, a quel punto viene tagliata questa sequenza sul sito “Pack” e si inizia ad impaccare al posto del cromosoma virale, il cromosoma batterico. Visto che non c’è un altro tipo di controllo su questa operazione, si continua ad operare in questa direzione senza interruzione e si riempiono tutte le teste del capside con del DNA batterico fino al riempimento dello stesso capside. Alcuni autori dicono però che avviene una lisi dell’acido nucleico batterico, che viene spezzettato in tanti frammenti e casualmente vengono incorporati quelli con la lunghezza esattamente uguale a quella del concatamero, questa teoria però non è molto accreditata perché è troppo bassa la probabilità che si vada a formare un frammento delle giuste dimensioni per un numero sufficientemente elevato di cellule, quindi la teoria precedente è la più accreditata.

Un batteriofago con del DNA batterico nella testa, può essere infettante per le altre cellule?

Assolutamente si, infatti non conta la natura dell’acido nucleico che presenta all’interno, ma è il capside che condiziona l’infettività del virus stesso. Dopo che il batteriofago con il DNA batterico ha infettato la cellula ospite si presentano molte possibilità, infatti esso può:

– essere degradato dalle endonucleasi, che sono degli enzimi di restrizione (in particolare essi tagliano l’acido nucleico in diverse sequenze)

integrarsi nel cromosoma in un punto di omologia, cioè dove trova una certa specificità di sequenza

– può chiudersi, circolarizzandosi a livello citoplasmatico, però non può replicarsi perché non possiede degli enzimi di replicazione. Quindi gradualmente con le divisioni cellulari diminuirà sempre la quantità di acido nucleico presente in questa macromolecola, fino a scomparire nelle generazioni successive (si parla così di trasduzione abortiva)

– andare ad integrarsi in un fattore F, quindi risulterà diventare una macromolecola che ha la capacità di autoreplicarsi e di autotrasferirsi, proprio per la presenza del fattore F

 

Questo tipo di trasduzione viene detta generalizzata poichè, nel caso di un errore, qualsiasi gene del batterio donatore (è la prima cellula che viene infettata dal virus) può essere trasferito al batterio ricevente, infatti ognuno dei batteriofagi che se ne esce dalla cellula donatore può portare via un frammento di cromosoma della cellula batterica, con questi frammenti che possono essere tutti diversi tra di loro.

La trasduzione specializzata

La trasduzione specializzata avviene ad opera dei profagi (che rappresentano i batteriofagi temperati), dove il DNA virale in questo caso non va a localizzarsi sui ribosomi, ma sul DNA della cellula ospite (questo somiglia al meccanismo di formazione delle cellule HFR), in maniera molto specifica tra il gene gal ed il gene bio. Questa sequenza di acido nucleico virale non viene espressa, perché l’unico gene che viene espresso ed è attivo, è quello che si chiama repressore, ed è importante perché reprime l’espressione di tutti gli altri geni virali. Finché funziona il repressore, nessuna sequenza virale viene espressa, e l’acido nucleico virale si replica insieme a quello batterico, come se fosse parte integrante del cromosoma batterico. Di tanto in tanto avviene che qualche gene che proviene dal batteriofago sfugga al controllo del repressore e venga tradotto in proteine, acquisendo quindi la potenzialità patogena di produrre delle tossine (si parla in questo caso di una conversione lisogenica). La conversione lisogenica è dunque un processo molto importante perché la cellula batterica acquisisce nuove potenzialità da dei virus che non traggono nessun vantaggio da questo tipo di processo.

Ecco perché non tutte le persone che sono stati colpite da una tonsillite hanno avuto poi la scarlattina (viene prodotta nella patologia della scarlattina una proteina che si chiama tossina eritrogenica, dove lo Streptococcus pyogenes, o Streptococco β-emolitico di gruppo A, ha subito l’infezione da parte di un batteriofago, e qualche gene di questo DNA virale è sfuggito al controllo del repressore, iniziando a produrre la tossina). Per vedere se il soggetto ha prodotto degli anticorpi per questa tossina eritrogenica, si usa la reazione di neutralizzazione di Dikke, allestita sul soggetto, si inietta infatti una piccola quantità di questa tossina nell’avambraccio e si osservano i risultati. Se il soggetto ha avuto la scarlattina non si riscontra nulla (contrariamente al risultato che si può osservare nel test della Mantoux), il potere tossico della tossina viene quindi inattivato dagli anticorpi se il paziente ha avuto già questa malattia. Ad esempio la reazione di Schick segue un procedimento analogo, ma si fa nei confronti della tossina difterica.

Una seconda tossina importante che viene prodotta in questo modo è la tossina difterica, questa tossina viene prodotta da ceppi microbici che fanno parte del Corynebacterium diphtheriae infettati dai virus. Il gene tox, che dal virus viene trasmesso e si va a localizzare sul cromosoma batterico, è quello che provocherà, sfuggendo al controllo del repressore, la produzione della tossina. Per queste ragioni bisogna valutare di frequente, nel soggetto che presenta la sintomatologia della difterite, se il batterio presente nelle fauci è tossigeno (e quindi pericoloso) o meno, se il batterio è tossigeno si aggiungono ai sintomi soliti della malattia, anche quelli d’intossicazione provocati da questa tossina, chiamata pantropa (ovvero che può colpire diversi distretti tissutali), che provoca un blocco della sintesi delle proteine nelle cellule muscolari per l’inibizione dell’azione dell’EF-2 (tra queste cellule citiamo anche quelle del cuore). 

Come si capisce la natura tossigena del batterio?

Questi batteri hanno delle peculiari caratteristiche, in relazione alla loro tintorialità, sono infatti dei batteri asporigeni, a forma bastoncellare, con dell’estremità arrotondate e dilatate a forma di clava, sprovvisti dei flagelli e di una capsula, la loro lunghezza varia dai 2 ai 6 mm mentre il diametro è compreso tra 0,5 e 1 mm.

Inoltre:

– Si dispongono ‘a lettere cinesi’, ovvero dopo essersi duplicati ruotano sul loro punto di contatto

– Sono dei batteri Gram-limite, ovvero possono essere sia Gram+ che Gram- a seconda dei tempi con cui noi andiamo ad operare la nostra colorazione

– Presentano dei granuli metacromatici

 

Per rilevare la presenza di questo batterio si parte da un tampone faringeo, e lo si dispone su un terreno chiamato di Löffler, che è interessante in quanto in esso i batteri formano delle colonie in pochissimo tempo, ovvero in circa 3-4 ore, viene quindi allestito un esperimento che si chiama tossinogenesi in vitro. A partire dalle colonie che sono cresciute in poche ore su questo terreno di coltura, si dispongono perpendicolarmente alcune di queste colonie (ma ne basta anche solo una) in una piastra, sul cui fondo sterile viene posta una striscia di carta assorbente imbevuta di anticorpi anti-tossina. Passato il tempo d’incubazione, se il ceppo era tossigeno, ci sarà un punto in cui, dopo essersi combinati l’antigene e l’anticorpo specifici della nostra tossina presa in esame, si crea un composto insolubile che precipita proprio lungo le bisettrici dell’angolo retto formato dalla nostra striscia assorbente e dalla coltura inoculata in questo terreno, questa è la prova che il batterio è tossigeno.

Molte altre sostanze vengono prodotte nel modo sovraesposto, ad esempio un gran numero di tossine del batterio Staphylococcus aureus vengono prodotte con questo meccanismo (sono le tossine enterotossiche), che indebolendo il soggetto, permettono al batterio di permanere all’interno del soggetto stesso per più tempo. Questo tipo di batteri ha inoltre acquisito il gene per la resistenza alla penicillina proprio con questo meccanismo, tramite una trasduzione virale.

Vediamo ora come avviene il distacco dell’acido nucleico virale:

– se si stacca in maniera ‘normale’ dai suoi margini, darà vita ad un ciclo litico normalissimo (e allora si parla di trasduzione generalizzata).

– se si stacca in maniera erronea e si porta via una sequenza di geni del cromosoma batterico, si vengono a formare delle particelle ibride, ed in particolare se queste particelle hanno una percentuale di DNA virale del 70 % o più, hanno ancora la possibilità di portare avanti il ciclo litico, se invece gli viene a mancare un frammento superiore al 30 % del genoma virale, non sono capaci di portare a termine il ciclo litico e devono aspettare l’infezione di un secondo batteriofago (chiamato fago “helper”), che con la sintesi proteica dei suoi geni permette al primo batteriofago di terminare il suo ciclo d’infezione. Nel primo caso abbiamo detto che il virus è in grado di dare origine a nuove particelle virali, che ora trasporteranno però un gene che di solito è adiacente al punto d’inserzione dell’acido nucleico virale, di solito in questo caso è il gene gal o il gene bio (questo meccanismo viene dunque chiamato trasduzione specializzata, proprio per l’elevata specializzazione dei frammenti che può portarsi con sé il virus nelle nuove particelle e per i punti d’inserzione del virus stesso quando s’integra nel genoma batterico).

I batteri trasducenti sono le Enterobacteriaceae, i vibrioni, il genere Bacillus, il genere Pseudomonas, gli streptococchi (per quanto riguarda la tossina eritrogenica), gli stafilococchi (per quanto riguarda la tossina enterotossica), i batteri difterici (per quanto riguarda la tossina difterica) ma ce ne possono essere anche diversi altri.

Per quanto riguarda le tossine prodotte attraverso il meccanismo di conversione lisogenica, tra queste possiamo citare le tossine del botulino, le tossine dello Staphylococcus aureus come l’enterotossina, la leucocidina o l’enzima coagulasi (in particolare l’attività coagulasica di questo batterio è l’attività più importante che permette di discriminarlo tra gli stafilococchi), ma anche alcune variazioni antigeniche delle salmonelle sono dovute a dei geni che vengono trasferiti mediante un batteriofago.