Tossine batteriche

Le tossine batteriche non vengono prodotte solo dai batteri ma anche da alcuni miceti. Le tossine prodotte dai batteri però sono quelle che hanno permesso di arrivare allo studio dei vaccini. Si parla di tossine ogniqualvolta certe molecole siano presenti nei batteri o siano prodotte dai batteri, quindi siano responsabili di un evento che prende il nome di tossigenicità, cioè “produzione di tossine che intossicano, danneggiano, anche fino alla morte, un organismo”.

Le tossine batteriche sono i primi fattori di virulenza identificati nella storia della microbiologia, sono i più facili da riconoscere. Alla fine dell’800 erano state già identificate come molecole che potevano essere secrete, rilasciate da un microrganismo ed essere in grado di provocare una malattia oppure un’alterazione di un tessuto, di un organo o di una funzione biologica.

Si utilizzarono due modelli, che poi sono gli stessi due sistemi che abbiamo oggi per dimostrare la presenza di una tossina: la somministrazione ad un animale e la somministrazione alle cellule in vitro, nei quali ovviamente vanno ricercati dei danni citopatici. Delle tossine batteriche sappiamo ormai molto, sappiamo che da alcune di queste è possibile costruire i vaccini. Da una tossina si può arrivare a costruire un’anatossina o un tossoide, ovvero una tossina che è stata modificata (attraverso il calore, invecchiandola in frigorifero, o con tecniche di ingegneria genetica), ha perso il potere patogeno ed ha mantenuto quello antigenico, quindi viene impiegata per indurre in un ospite una protezione attiva, ovvero per vaccinare.

Che cosa sono queste tossine? Sono le componenti di un batterio che possono danneggiare l’ospite direttamente o indirettamente. Alcune sono direttamente responsabili di un danno tissutale e cellulare, attraverso un’interazione con degli specifici recettori, responsabili del tropismo. Altre invece sono indirettamente responsabili attraverso l’induzione di una cascata di eventi che poi potranno portare alla morte della cellula stessa.

Alcune tossine sono degli elementi della cellula stessa, quindi sono parte integrante della struttura, altre sono invece delle molecole che vengono rilasciate nel mezzo, altre ancora possono essere iniettate nella cellula bersaglio.

Facciamo una prima grossa distinzione: le endotossine e le esotossine

Le endotossine sono parte integrante della cellula (è quello che avevamo chiamato lipopolisaccaride, o LPS, quando abbiamo parlato della membrana). Se è una parte integrante della cellula vuol dire che questa tossina viene rilasciata soltanto se la cellula, cioè il batterio, muore. E’ una molecola di natura lipidica e per questo non è quasi per niente immunogenica, e non riesce, così com’è fatta, a essere facilmente detossificata. E’ abbastanza termostabile, quindi anche le alte temperature e la bollitura non la degradano: questo può essere un grosso limite perchè non basta scaldarla per inattivarla. Sono resistenti ai succhi gastrici e quindi possono andare a creare un danno enterico. La loro tossicità non può essere neutralizzata dagli anticorpi, l’organismo non riuscirà quindi mai a difendersi da un’endotossina, a differenza delle esotossine. Quindi sono molecole complesse da un punto di vista biochimico.

Le esotossine sono rilasciate all’esterno dalla cellula, sono sempre proteine, a volte glicosilate ed a volte no. Se sono delle proteine, vuol dire che sono codificate da geni, e questo è un grosso vantaggio: una volta che è stato identificato un gene per una particolare tossina, noi possiamo costruirla in laboratorio, questa è la grossissima differenza.

Se sono delle proteine, sono piuttosto termolabili, molte di queste sono distrutte dai succhi gastrici e possono essere neutralizzate da un anticorpo. Questo è un concetto molto importante, per il quale può essere costruito con successo un vaccino. Una volta che ho capito qual è la tossina che mi determina una certa malattia, possiamo detossificarla attraverso l’ingegneria genetica e possiamo dire a quell’ospite di costruirsi degli anticorpi che siano neutralizzanti.

 

Come e quando si producono le tossine

L’endotossina è una parte integrante di una superficie batterica, quindi se c’è il batterio, c’è anche la tossina. Le esotossine non sono sempre prodotte da tutti i ceppi, quindi è importante capire se siamo in presenza di un batterio che produce la tossina oppure no.

Questa tossina non è prodotta a caso ma segue una logica precisa, esistono dei sistemi che controllano i livelli di espressione della tossina stessa.

Se le tossine non sono prodotte da tutti i batteri, ma solo alcune volte, cosa vi fa pensare questa cosa?

Le tossine sono delle proteine ed hanno un codice genetico. La loro localizzazione non è codogenica, non è un gene essenziale ma passa da un batterio all’altro attraverso un plasmide, attraverso la coniugazione, oppure più spesso attraverso dei fagi. Quindi le tossine sono spesso figlie di un evento aggiuntivo, il batterio la acquisisce. Non è un gene essenziale ma è un optional legato ad un evento molecolare.

In sostanza le tossine sono trasmesse attraverso la coniugazione (plasmide), oppure raramente attraverso la trasformazione, oppure più spesso attraverso la trasduzione (fago).

Un esempio è la tossina della difterite.

Il prossimo anno parleremo di molte tossine che finiscono in questa categoria.

La difterite ha una tossina pantropa, che ha un effetto ADP-ribosilante letale per la cellula. L’antigene per questa molecola è trasferito da un fago temperato: si inserisce nel genoma del batterio e sta lì senza danneggiare la cellula, però dando ad essa la possibilità di codificare per questa proteina.

Il fago beta o omega è il portatore del gene che codifica per questa tossina. Questa tossina non solo è un optional, ma una volta importata all’interno del genoma viene espressa secondo una logica precisa: viene regolamentata dai livelli di ferro. La tossina difterica è inversamente proporzionale ai livelli di ferro. I batteri infettati dal fago non producono sempre la tossina, che non è un promotore virale incontrollato, ma è il batterio stesso che decide quando produrre questa tossina. Tanto più ferro c’è, tanta meno tossina viene prodotta e viceversa.

In un modo molto arguto il batterio riesce a gestirsi: il ferro è un elemento importante e nel momento in cui il batterio va in crisi da scarsa presenza di ferro, questo produce la tossina, che uccide la cellula che sta intorno (può essere la cellula eucariotica dell’ospite oppure le altre cellule del mondo esterno), dalla quale si rilascia ferro.

Le tossine dei batteri sono prodotte non a caso ma se servono, quindi possono essere prodotte se dev’essere sfondato un tessuto, se dev’essere colonizzata una particolare cellula, oppure, come in questo caso, se manca l’elemento nutrizionale di base (il ferro). C’è un repressore che viene represso se manca il ferro, quindi esiste un sistema di regolamentazione genica strettamente legato alla presenza di ferro. Se il ferro è troppo poco, il repressore si stacca, parte la trascrizione e viene tradotto il gene per la tossina.

Nella stessa maniera vengono regolate le tossine del botulino, della scarlattina, quella dello shock tossico e tante altre.

La determinazione della presenza di una tossina

La presenza di una tossina è importante determinarla. Ci sono tanti modi, io descriverò i due più classici, ma esistono anche degli altri metodi un po’ più attuali, ancora non del tutto canonizzati.

Linee cellulari continue in vitro

Perchè è importante stabilire se c’è una tossina in un campione biologico? Perchè non tutti i batteri producono la tossina, quindi il fatto che ci sia il Corynebacterium diphtheriae nella gola di un bambino non vuol dire che questo vada in difterite, perchè se è un “diphtheriae” senza gene la colonizzazione non avrà nessun significato clinico.

La presenza della tossina si valuta attraverso dei saggi biologici, per cui la tossina viene inoculata nell’animale da esperimento o in linee cellulari continue in vitro, sensibili a questa tossina.

Avrete già sentito parlare di cellule ILA, cellule VERO, cellule H o di fibroblasti, cioè cellule mantenute in coltura tanto tempo, da decenni, che possono essere sensibili o meno a certe tossine.

Queste linee cellulari, se sono esposte ad una sospensione dove c’è la tossina, cambiano fisionomia: compare il cosiddetto effetto citopatico, per cui diventano degranulate, non sono più ben allungate, diventano tondeggianti, si distaccano e muoiono. Esistono dunque una serie di elementi morfologici che possono essere visualizzati attraverso il microscopio e ci consentono di stabilire se in un certo campione biologico c’è o meno la tossina, perchè compare o meno l’effetto citopatico nella cellula sensibile, nella cellula bersaglio.

Il modo canonico per testare le tossine è quello di esporre questo campione da saggiare su delle cellule sensibili.

Animali da esperimento

L’altro modo invece è quello di inocularlo in animali da esperimento. Ad esempio se è presente la tossina del tetano, l’animale da esperimento mostrerà i sintomi del tetano, se è la tossina del colera, mostrerà invece la patologia legata alla disfunzione dell’intestino e allora si parla del cosiddetto test delle anse ileali, per cui l’intestino dell’animale si rigonfia in maniera non fisiologica, perchè l’epitelio dell’intestino riversa l’acqua all’interno del lume, rigonfiandolo in maniera molto evidente.

Anche questo è un test classico, usato ormai da 50 anni.

Altri test

I test in più che si possono fare sono ad esempio la PCR o i test molecolari in cui in un campione biologico noi andiamo a testare se c’è la sequenza di DNA che codifica per quella tossina. Ciò dimostra la presenza molecolare della tossina e quindi determina il potere, il potenziale patogeno di quel microrganismo.