Terreno Agar

L’agar, un polisaccaride acido estratto da un’alga rossa, è l’addensante che provoca il cambiamento di stato fisico, infatti spesso la differenza tra un terreno liquido ed uno solido è solo la presenza dell’agar nel terreno solido, di solito alla concentrazione del 1,5 %, come nel caso di questi due terreni:

– tryptic soy broth o TSB (brodo di triptone e soia) e tryptic soy agar o TSA, tra i quali l’unica differenza è l’aggiunta del 1,5 % di agar nel secondo terreno di coltura. Il primo è un brodo (è simile per aspetto al brodo dei tortellini, al massimo è più chiaro perché il brodo dei tortellini non è filtrato), il secondo è lo stesso brodo con l’aggiunta del 1,5 % di agar che lo addensa: essendo l’agar una sorta di intelaiatura, di spugna, assorbe tutto il brodo e lo fa addensare, naturalmente è comunque in grado di cedere i materiali nutrizionali ai batteri che sono posizionati sul suo substrato. Variando la percentuale di agar vado a modificare la grandezza delle maglie di questa intelaiatura: se l’aumento ad esempio al 3 % le maglie si restringono e l’intelaiatura dell’agar diventa più compatta, al contrario se ad esempio dimezzo la sua percentuale allo 0,75 % le sue maglie saranno più lasse. Infatti, per verificare la motilità di un batterio, una possibilità è quella di seminarlo in un’inclusione in una provetta di agar molle, cioè un TSB al quale aggiungo lo 0,7 % di agar: parto da una piastra con una colonia del batterio sul quale voglio determinare la sua mobilità o meno, raccolgo una seconda colonia e la vado a seminare parallelamente all’asse della provetta contenente l’agar molle, così se il batterio è mobile crescerà diffondendo dalla linea di inoculo anche lateralmente, viceversa avrà una crescita esclusivamente nel punto in cui ho seminato il batterio. Questo perché l’agar molle, avendo una percentuale minore di agar, ha le maglie più larghe delle dimensioni del microrganismo stesso ed il batterio non solo non rimane in superficie, ma è anche in grado muoversi all’interno delle maglie. Alla concentrazione del 1,5 % si crea un’intelaiatura con delle maglie di dimensioni inferiori a 0,45 µm, che non permettono al microrganismo di cascare dentro l’intelaiatura, quindi in questo caso il batterio rimane in superficie.

L’unico batterio che riesce a cascare dentro le maglie di un agar alla concentrazione di 1,5 % è il micoplasma, che ha delle dimensioni di 0,25 µm, ed essendo un “mollicutes”, ovvero senza parete batterica, riesce ad invaginarsi nelle maglie che comunque sono più grandi delle sue dimensioni.

Il fatto che i batteri rimangano in superficie sull’agar normale mi permette di poter osservare le caratteristiche delle colonie che formano: la forma, i margini, se sono delle colonie mucose o meno, il colore ed altre caratteristiche ancora.

Il TSB è il brodo più usato, ma ce ne sono anche di più semplici, come il “nutrient broth”, che è un po’ meno ricco, perché è un estratto solo di carne, senza soia, con la seguente composizione:

0,5 % di peptoni (ottenuti dalla digestione enzimatica della carne) addizionati dello 0,3 % di estratto di carne. Il tutto è portato mediante il NaCl alle condizioni di isotonicità ed a pH 7 mediante il tampone fosfato. Aggiungendo il 1,5 % di agar al “nutrient broth” ottengo l’Agar normale (o “nutrient agar”).

 

Per i batteri più esigenti dal punto di vista nutrizionale, il TSA può essere addizionato con delle sostanze che aumentino la capacità nutrizionale o metabolica a carico della cellula, cioè permette al microrganismo di ricavare delle sostanze che sono importanti per il suo metabolismo.

Alcune di queste sostanze sono il sangue, il siero, il liquido ascitico, l’estratto di lievito, le vitamine e dei particolari amminoacidi, importanti per lo sviluppo di alcuni batteri con certe esigenze specifiche.

COME SI è ARRIVATI AD USARE L’AGAR NEI TERRENI DI COLTURA

I primi terreni usati erano liquidi, ed osservando una coltura in un terreno liquido si vede solo una torbidità diffusa, che non permette di distinguere un batterio di una specie da quello di un’altra, quindi isolare i batteri da una coltura mista per poi ottenere delle colture pure era una vera impresa. Disponendo invece di un supporto solido, è possibile osservare la colonia e valutarne alcune caratteristiche, come la morfologia ed il colore, che sono dei suggerimenti utili nell’identificazione del tipo di batterio. Quindi, all’epoca, per isolare un batterio l’unico sistema era procedere ad una serie di diluizioni all’infinito: si prendeva un terreno di coltura, si diluiva a concentrazioni batteriche sempre più basse e si andava avanti, così che nell’ultima provetta non cresceva più nulla dopo l’incubazione, cioè era sterile, allora si prendeva la penultima provetta presupponendo che lì ci fosse un solo batterio. Ovviamente era un metodo grossolano e abbastanza difficile da eseguire, allora si è cercato da subito di ottenere un terreno di coltura solido.

Koch ed i suoi collaboratori in una pubblicazione (nel 1881) spiegarono come ottenere una coltivazione in un terreno solido impiegando le patate bollite (erano sterili). Calmette e Guerin per far crescere il bacillo tubercolare utilizzavano delle fette di patate biliate (ovvero con la bile) sulle quali seminavano il bacillo tubercolare, poi mettevano il preparato sotto una campana di vetro per proteggerlo dalla disidratazione e dagli agenti esterni presenti nell’aria, poi quando serviva il batterio lo “pescavano” da questo terreno solido. Poi dopo 40 anni che utilizzavano questo ceppo su questa patata è avvenuta una mutazione che ha fatto perdere le potenzialità patogene al batterio, infatti adesso si utilizza quel ceppo come vaccino (si parla del bacillo di Calmette-Guerin). Ma non tutti i batteri riuscivano a crescere sulle fette di patata.

Nello stesso periodo un collaboratore di Koch (chiamato Loeffler) sviluppò un terreno basato sull’estratto di carne (prima si usavano dei terreni molto meno arricchiti), nel quale crescevano dei batteri patogeni.

Koch, che era un esperto fotografo, decise di provare a solidificare il brodo impiegando la gelatina che utilizzava per preparare (insieme ai sali d’argento) le lastre fotografiche. Fece quindi solidificare il brodo con la gelatina ed ottenne un ottimo terreno di coltura solido, purtroppo però la gelatina fonde a 25° C circa e solo i batteri che si sviluppano a temperature minori di 25° C potevano essere coltivati su questo terreno, ma non i patogeni che devono essere incubati a 37° C. Oggi i terreni alla gelatina vengono ancora utilizzati ma per scopi diversi dalla coltura dei batteri, come ad esempio per indagare la presenza di germi proteolitici: si fa sciogliere la gelatina, si versa nel campione da analizzare e se c’è il batterio proteolitico questo fonde la gelatina e si viene a creare un buco nell’agar.

Circa un anno dopo fu usato l’agar per la prima volta (in realtà la sostanza era stata scoperta molto tempo prima da un ristoratore cinese che gettando tra i rifiuti le zuppe di alga avanzate aveva trovato al mattino a causa del freddo della notte invernale una densa gelatina). Fu la moglie di un collaboratore di Koch che impiegava l’agar in cucina (si usa tutt’oggi nelle marmellate) che suggerì di impiegare l’agar come addensante del brodo.

LE CARATTERISTICHE DELL’AGAR

  • Crea un’intelaiatura con delle maglie di 0,45 µm (alla concentrazione del 1,5 %)
  • Variando la sua percentuale ottengo l’agar molle, per la verifica della mobilità (c’è una concentrazione dello 0,7 %)
  • Cede per capillarità i nutrienti ai batteri che vengono a contatto con la sua superficie
  • È sufficientemente idratato, ma non abbastanza da permettere il passaggio del batterio da un punto all’altro. Questo è utile nel conteggio, perché il batterio non si muove dal punto in cui lo semino: se voglio sapere quanti batteri ho in un campione, vado a seminare 100 µL del mio campione su una piastra, se in questi 100 µL che ho prelevato ho pescato solo 3 batteri, andando a seminare sulla piastra il giorno dopo vedrò 3 colonie crescere in punti diversi della piastra, mentre se il batterio avesse la possibilità di muoversi dopo aver formato una colonia si sposterebbe e ne formerebbe un’altra, e dopo un certo tempo ne formerebbe un’altra ancora in un altro punto, cioè otterrei molte più colonie di quanti erano i batteri nel mio campione seminato.

Per stabilire se un soggetto ha certamente la cistite devono essere rappresentati nelle urine come minimo 2 * 104 batteri / ml, se sono di meno si considera qualcosa di aspecifico, ma di solito quando ci sono delle cistiti serie abbiamo delle cariche superiori al milione. Il conteggio è anche usato nelle analisi dell’acqua erogata dai comuni. Quindi in questo caso vado a fare un conteggio sfruttando l’incapacità dei batteri di muoversi sull’agar

  • L’agar ha un’ECCEZIONALE FRENATA AL MOVIMENTO

Nessun batterio riesce a muoversi sull’agar, oltretutto quando si seminano dei batteri sulla superficie dell’agar bisognerebbe asciugare molto bene le piastre, mettendole sotto una cappa, dove raggiungono delle temperature maggiori, in modo da rendere la superficie più secca. Questo perché c’è una specie microbica che, se la piastra è abbastanza idratata, riesce a spostarsi sulla superficie dell’agar, ovvero il Proteus, che ha la capacità di sciamare, cioè di spostarsi sulla piastra con l’agar, anche se ci sono degli altri batteri che hanno formato delle colonie. Se un Proteus finisce sulla piastra in un punto, comincia a sciamare e copre con una patina trasparente tutta la superficie dell’agar, anche dove ci sono gli altri batteri al di sotto. Se il giorno dopo voglio isolare uno di quei batteri, pesco dalla piastra ma mi tiro dietro anche la patina del Proteus, che essendo trasparente non è neanche facile da riconoscere in superficie

  • Non è commestibile per la maggior parte dei batteri, infatti lo usiamo come materiale di sostegno, non come un materiale nutrizionale

LA PREPARAZIONE DI UN TERRENO SOLIDO

Nell’immagine vediamo i matracci contenenti un brodo che è liquido, un terreno MacConkey, un mannitol-salt agar ed un TSA, che sono dei terreni solidi che vengono venduti in polvere con le istruzioni precise per prepararli: come scioglierli (ovvero quanta polvere sciogliere in quanta acqua distillata), per quanto tempo portare ad ebollizione a bagnomaria (di solito mezz’ora) ed a che temperatura. Poi il terreno ancora liquido va disposto in beute da 250 ml l’una, che vanno chiuse in maniera asettica e posizionate in autoclave a 121° C per 15 minuti. A questo punto il terreno è liquido, se non ne abbiamo bisogno subito dopo un po’ solidifica e viene messo in frigo. Quando ne avremo bisogno di nuovo, la beuta viene messa ancora a bollire ed il terreno si scioglie di nuovo (oppure lo metto nel forno a microonde che si fa ancora prima). Ora il terreno liquido può essere versato sulle piastre in misura di 15-20 mL ciascuna e nel giro di 3 minuti il terreno solidifica e la piastra è pronta per essere seminata.