Terreni di coltura batterica

 

  • Gli studi di microbiologia dipendono molto dalla capacità di fare crescere e mantenere i microrganismi nelle colture di laboratorio, che è una cosa possibile disponendo dei terreni adeguati.
  • Un terreno è adeguato se contiene tutti i nutrienti di cui il batterio ha bisogno per svilupparsi. Queste fonti di energia sono di solito il carbonio, l’azoto, il fosforo, lo zolfo e vari minerali, ma l’esatta formula del terreno dipende da quale batterio si intende coltivare.
  • Sviluppare dei microrganismi in vitro è necessario per poterli studiare dettagliatamente dopo averli identificati ed in ultima analisi è importante verificarne anche la sensibilità agli antibiotici, che è normalmente lo scopo ultimo di un’analisi batteriologica.

Per disporre del batterio che ci interessa, o per isolarlo da un campione biologico, alimentare o ambientale, dobbiamo mettere i microrganismi presenti nel campione in condizione di potersi sviluppare, cioè in condizioni simili a quelle che essi riscontrano normalmente nel substrato che vanno a colonizzare.

Un terreno di coltura è un ambiente artificiale che riproduce le ideali condizioni metaboliche di sviluppo del microrganismo.

Esistono due tipi principali di terreni di coltura:

  • Sintetici: quelli di cui si conosce l’esatta composizione, cioè l’esatta percentuale delle sostanze che sono addizionate. Questi non sono i terreni tradizionalmente usati per le analisi batteriologiche dei campioni, al massimo fanno parte di particolari esperimenti di laboratorio. Sono detti anche terreni minimi perché alcuni batteri riescono a svilupparsi in questi terreni ad altri no, perché sono auxotrofi per un determinato carattere [il termine auxotrofia indica l’impossibilità per un organismo di sintetizzare un particolare composto organico necessario per la propria crescita, che deve quindi essere assunto necessariamente dall’ambiente, in aggiunta ai nutrienti energetici forniti dall’alimentazione]
  • Complessi: sono quelli che si usano per le tradizionali valutazioni microbiologiche. Si modificano leggermente l’uno dall’altro, per permettere ad alcuni batteri di svilupparsi rispetto ad altri, perché hanno delle preferenze particolari. Generalmente contengono tutti una serie di sostanze indispensabili per produrre energia (il carbonio, l’azoto, il fosforo, lo zolfo e vari minerali).

Alcuni microrganismi autotrofi fotolitotrofici (i cianobatteri e le alghe eucariote) possono essere coltivati in terreni relativamente semplici, contenenti CO2 come fonte di carbonio (ad esempio il carbonato di sodio), il nitrato o l’ammoniaca come fonte di azoto, il solfato, il fosfato e vari minerali.

Altri batteri come le Neisserie patogene sono invece particolarmente esigenti dal punto di vista nutrizionale e necessitano di terreni arricchiti. La Neisseria gonorrhoeae è molto esigente sia per le sue caratteristiche nutrizionali che per l’abitudine a moltiplicarsi solo a temperature ben definite (se sbagliamo anche di poco la temperatura d’incubazione possono non svilupparsi).

Ad ogni modo sono pochi i casi in cui la temperatura deve essere assolutamente stabile, la maggior parte dei patogeni infatti crescono ugualmente anche se la temperatura non è esattamente quella ottimale, ovvero di 37° C, mentre gli ambientali o i commensali, che non hanno delle esigenze particolari, riescono a moltiplicarsi anche a temperature diverse. Una particolarità per distinguere le Neisserie patogene da quelle commensali, presenti nel cavo orale, è che le non patogene si sviluppano anche sui terreni non arricchiti e non solo ad una temperatura di 37° C, mentre il patogeno deve necessariamente trovarsi in un ricco terreno di coltura e ad una temperatura costante di 37° C, delle condizioni che mimano esattamente la situazione all’interno dell’ospite.

LA RICETTA DI BASE DEI TERRENI DI COLTURA NORMALMENTE UTILIZZATI

I terreni generalmente impiegati, a differenza dei terreni complessi, contengono dei componenti a composizione indefinita:

  • Peptoni: idrolati proteici che derivano dalla parziale digestione proteolitica della carne, della caseina, della farina di soia ed altre fonti proteiche. Dai peptoni si raccolgono in sostanza le proteine che sono fonti di carbonio, energia ed azoto.
  • Estratto acquoso di carne magra di bue: contiene aminoacidi, peptidi, nucleotidi, acidi organici, vitamine e minerali.
  • Estratto acquoso di lievito di birra: è un’eccellente fonte di vitamina B e di composti dell’azoto e del carbonio.

Questa è la ricetta di base, che può essere modificata a seconda dell’uso che devo fare del mio terreno.

I terreni sono commercializzati in forma di liofilizzati (sono piuttosto costosi), che devono essere sospesi in una certa quantità di acqua distillata sterile, ottenendo una soluzione che poi va messa in autoclave prima di essere impiegata per la semina. Fino a poco tempo fa si preparavano dei terreni di coltura ancora a partire dalle strutture di base (i vegetali, le carni e gli organi), che venivano fatte bollire e poi si otteneva un estratto a caldo, esattamente come si prepara il brodo dei tortellini, che infatti è un ottimo brodo di coltura.

Oltre ai peptoni, agli estratti di carne ed agli estratti di lieviti, dai quali il batterio può ricavare sia l’energia che i “mattoni” per la costruzione delle varie strutture, il terreno deve essere un ambiente in cui il batterio si può sviluppare, è perciò necessario che sia presente una certa concentrazione di sali, che permettano l’acquisizione di una certa isotonicità: non possiamo mettere il batterio in un ambiente ipertonico od ipotonico perché, anche se è dotato di una parete batterica, viene stressato da questo ambiente (ricordiamo che la parete batterica è importante soprattutto quando c’è l’acqua in ingresso nella cellula, cioè in condizioni di ipotonicità, che crea la tendenza a far l’entrare acqua nel microrganismo ed a farlo rigonfiare), ma è anche importante mantenere il pH ai valori fisiologici di 7, ad esempio con l’aggiunta del sistema tampone fosfato (il tampone fosfato è presente nel “nutrient broth”, che veniva usato come principale terreno di coltura fino a qualche anno fa, ma ora si preferisce il “tryptic soy broth”).

I TERRENI MINIMI

  • Soddisfano le minime esigenze nutritizie del batterio
  • È presente l’acqua, una fonte di carbonio (il glucosio), una fonte di azoto (il solfato di ammonio) ed i sali minerali
  • Hanno una composizione chimica nota, con le quantità standardizzate
  • Ovviamente questi terreni non si usano per una semina di campioni biologici, ma sono usati solo per gli scopi sperimentali in laboratorio, quali possono essere:
  • studio del metabolismo
  • dosaggi microbiologici
  • selezione dei mutanti biochimici à come ad esempio nella coniugazione di Lederberg : tra due Escherichia coli auxotrofi per 3 caratteri, messi insieme questi due batteri per 24 ore e seminati sullo stesso terreno minimo, crescevano i ricombinanti che avevano acquisito le caratteristiche per diventare prototrofi [prototrofo = che richiede gli stessi nutrienti, come la maggior parte dei membri selvatici della sua specie] e non erano più auxotrofi.

 

I TERRENI SOLIDI E LIQUIDI

I terreni di coltura possono essere differenziati in base allo stato fisico, che a sua volta è dovuto di solito alla presenza o meno dell’agar.

liquido à brodo colturale: lo sviluppo del batterio al suo interno si appalesa come una torbidità del liquido che non mi permette di distinguere le varie specie microbiche presenti nel campione, perciò la coltura in un terreno liquido si effettua per ottenere una coltura pura di un ceppo unico.

solido à agar-coltura: il batterio ha un supporto fisico, si moltiplica senza spostarsi e crea una colonia che è visibile ad occhio nudo.