Ricombinazione genetica

 

I meccanismi alla base della differenziazione dei batteri sono:

  1. Mutazione, è un evento casuale o indotto, ad esempio attraverso il test di Ames abbiamo visto che ci sono delle sostanze in grado di aumentare anche a 105 la frequenza mutazionale (in una coltura microbica di 10 ml solitamente sono contenuti 5*1010 batteri, quindi si ha la certezza di individuare un gene mutato per qualsiasi carattere), anche se abbiamo visto che una mutazione non è sufficiente a propagare il gene, ma occorrono anche degli altri meccanismi
  2. Selezione dell’ambiente, può avvantaggiare il microrganismo mutato (ad esempio per un antibiotico-resistenza), ad esempio un ceppo microbico che acquisisce la capacità di sopravvivere in un terreno addizionato con un antibiotico, perché produce un enzima che lo degrada
  3. Ricombinazione, in questo caso il batterio trasferisce il gene (anche con un’elevata frequenza) alle cellule dello stesso habitat (ed alcune volte i geni possono fare dei salti in specie diverse, comportando un salto evolutivo nell’organismo che li acquisisce)

In generale le mutazioni sono alla base della differenziazione di tutti i ceppi presenti oggigiorno in natura, ed i meccanismi di ricombinazione arricchiscono la possibilità di scambio genico.

Tra i casi di ricombinazione dobbiamo citare però anche gli eventi che accadono in una singola cellula batterica, dove le sequenze d’inserzione sono delle strutture semplici, chiamate anche geni ballerini, che possono saltare da un punto di un cromosoma ad un altro punto, da un cromosoma ad un plasmide e viceversa. Sono costituite da 2 sequenze di nucleotidi esterni uguali e ripetuti, mentre in mezzo sono presenti i geni per la trasposizione, che codificano solamente per quegli elementi che favoriscono la trasposizione, generalmente per una trasposasi, un enzima che permette la traslocazione da un punto all’altro di un cromosoma di questa sequenza d’inserzione.

I trasposoni sono invece delle sequenze d’inserzione con all’interno dei geni non legati alla funzione di trasposizione, ma funzionali alla cellula batterica (queste frazioni di DNA sono presenti anche nelle cellule eucariotiche), questi trasposoni sono delle sequenze geniche che muovendosi sul DNA batterico interrompono la continuità delle basi di un gene, sono alla base infatti di numerose mutazioni, le quali possono essere letali o possono portare all’acquisizione di nuovi caratteri.

Esistono diverse varianti dei trasposoni:

  • I trasposoni coniugativi, in grado di trasferirsi da una cellula all’altra indipendentemente dal fattore F, sono riusciti a trasferire anche dei geni di resistenza come quello per l’ampicillina, la tetraciclina e le enterotossine
  • alcuni non si replicano
  • altri si replicano, cioè una copia rimane nella sede precedente e l’altra si sposta (su un cromosoma o su un plasmide)
  • altri sono invertibili, cioè ruotano di 180° rendendo vana la lettura del gene che trasportano. Ad esempio la sequenza per l’antigene del flagello delle salmonelle, quando è orientata da una parte attiva l’antigene 2 e reprime l’antigene 1, mentre quando ruota di 180 gradi, rende vana la lettura del gene bloccando la trascrizione dell’antigene 2, ma favorendo questa volta la produzione dell’antigene 1, così, modificando la sua struttura antigenica, il batterio ha più possibilità di continuare l’infezione. Ci sono anche delle capsule batteriche capaci di modificare la struttura antigenica della cellula batterica, rendendola simile a quelle dei nostri tessuti, ad esempio la capsula dello Streptococcus pyogenes (un batterio patogeno) è rivestito da acido ialuronico, una molecola che è parte dei nostri costituenti e non viene distrutta dagli anticorpi, questo è un classico caso di mimetismo antigenico

L’esatta distribuzione dei geni all’interno del cromosoma non è stabile e permanente, perché alcuni geni possono staccarsi da un punto del cromosoma ed andare a legarsi in un altro sito del cromosoma, solitamente ad elevata omologia con il primo sito. Certe volte questi trasposoni si replicano e si spostano da un’altra parte, mantenendo una copia della loro sequenza sia nella localizzazione originaria che in quella in cui si sono appena trasferiti, quindi mantengono i contatti in entrambi i punti, mentre altre volte si spostano direttamente da un punto e vanno sull’altro, si parla quindi rispettivamente di trasposizione replicativa e di trasposizione conservativa. Parlando invece delle sequenze d’inserzione (lunghe da 500 a 7000 coppie di basi), anche se non codificano per nessun gene, con il loro movimento possono interrompere la continuità di un gene e creare dunque una mutazione. Tutti questi fenomeni sono chiamati trasposizioni e rappresentano un formidabile strumento evolutivo, infatti il 45 % del genoma umano è costituito da residui di trasposoni. I trasposoni rispetto alle sequenze d’inserzione rimangono comunque gli elementi più importanti, in quanto oltre alla sequenza d’inserzione che hanno lateralmente, presentano centralmente delle sequenze geniche che possono codificare per dei caratteri di resistenza o per dei caratteri diversi di virulenza, come delle tossine. Ad esempio la resistenza alla vancomicina (che di solito rappresenta l’ultimo elemento difensivo terapeutico di alcuni microrganismi, tipo gli enterococchi e gli stafilococchi) sta trasmettendosi grazie alla presenza di un trasposone che viene trasferito tra le cellule adiacenti, facendole diventare a loro volta resistenti a questo antibiotico.

Il ruolo dei trasposoni lo possiamo anche vedere nella variazione della composizione antigenica dei flagelli della salmonella, che sono importanti perché permettono di caratterizzare questo batterio dal punto di vista sierologico. L’antigenicità di una Salmonella è costituita dal soma batterico (in cui è presente l’antigene O) e dall’antigene flagellare H. In base alla fase in cui questi batteri si trovano, si può avere un antigene flagellare H1 od un antigene flagellare H2. Questa variazione di fase dello stesso antigene è dovuta ad un trasposone che può invertire la sua disposizione sul cromosoma ribaltandosi di 180 gradi, quindi quando la salmonella esprimerà l’antigene H1, l’antigene H2 sarà represso, mentre quando l’antigene H2 sarà espresso, allora sarà l’antigene H1 ad essere represso.

I meccanismi di ricombinazione genica che conosciamo sono essenzialmente tre:

  • Trasduzione
  • Trasformazione
  • Coniugazione

LA TRASDUZIONE

È un meccanismo di trasferimento del materiale genico che si avvale della presenza di un vettore, che funge da veicolo di trasporto di questo stesso materiale genico, solitamente è un batteriofago, un virus specializzato nell’infettare le cellule batteriche. Il batteriofago, dalla cellula che ha infettato, passa ad infettare un’altra cellula e trasferisce non tanto il suo materiale genetico, ma parte di quello che era contenuto nel cromosoma della cellula batterica precedentemente infettata, quello che ancora non si capisce è dal punto di vista evolutivo quali vantaggi questo virus possa ottenere, perché trasferisce una sequenza di acido nucleico da un batterio ad un altro batterio, rimanendo senza il suo patrimonio genico e non potendosi replicare.

LA TRASFORMAZIONE

Il primo meccanismo di trasformazione fu studiato nel 1928 da Griffith, dove una sequenza di acido nucleico che si era liberata da una cellula lisata era in grado di essere captata da una cellula recettiva in uno stadio particolare, definito stato di competenza, e con un meccanismo particolare riesce a penetrare e ad inserirsi all’interno del cromosoma della cellula ricevente.

LA CONIUGAZIONE

È un processo di ricombinazione genica in cui una sequenza di acido nucleico, ovvero un plasmide o un cromosoma, passa da una cellula donatrice ad una cellula ricevente tramite il contatto fisico, con la formazione di ponti protoplasmatici (il protoplasma è l’insieme delle strutture cellulari che sono delimitate all’esterno dalla membrana cellulare), che trasferiscono le sequenze geniche, le quali vengono ricostituite nella cellula donatrice.

Lederberg e Tatum misero a punto nel 1946 un esperimento per dimostrare il trasferimento genico attraverso la coniugazione, da una cellula all’altra. Essi crearono in laboratorio due ceppi di batteri auxotrofi per due caratteri, ovvero dei batteri non in grado di costruirsi un enzima per due caratteri, di conseguenza con dei blocchi metabolici che non ne permettevano lo sviluppo su un terreno minimo di coltura. In particolare le cellule del ceppo 1 erano auxotrofe per la metionina e la biotina (A e B), mentre le cellule del ceppo 2 lo erano per la leucina e la treonina (D e C). Mettendo insieme questi due ceppi in un’unica brodocoltura a 37° C per 24 ore, poi seminando in una piastra questi batteri, contenente ancora questa volta soltanto il terreno minimo di coltura, i due scienziati videro che questa volta si svilupparono delle colonie con dei batteri prototrofi, che non potevano essere dei mutanti, perché le colonie erano migliaia, quindi l’unica ipotesi che poteva verificare quello accaduto in laboratorio, era che vi fosse stata una ricombinazione tra i batteri. Essi pensarono però inizialmente che si fosse formato uno zigote, cioè che le due cellule si fossero fuse.

Soltanto qualche anno dopo un altro scienziato dimostrò che questo processo era in realtà un trasferimento unidirezionale di materiale genetico da una cellula donatrice ad una cellula ricevente. Egli creò un mutante nei confronti dell’antibiotico streptomicina, poi seminando il ceppo 1 streptomicina-resistente ed il ceppo 2 normale (streptomicina-sensibile) su un terreno minimo di streptomicina, vide che non cresceva nulla, allora fece l’esperimento opposto seminando il ceppo 2 streptomicina-resistente ed il ceppo 1 normale, vedendo che si svilupparono numerose colonie. Questo ci fece capire che esisteva un fattore che causava l’unidirezionalità alla coniugazione, un fattore F di fertilità, solitamente presente su un plasmide. La cellula donatrice, per trasferire il suo materiale genetico, deve possedere un corredo genico di solito localizzato su un plasmide, che viene definito fattore F, ovvero di fertilità.

Ritornando all’esempio di prima, affinché possa crescere un ricombinante nella piastra addizionata di streptomicina su un terreno minimo di coltura, la cellula ricevente deve essere resistente alla streptomicina, ma deve anche acquisire i geni che gli mancano per diventare un batterio prototrofo, in particolare li deve acquisire dalla cellula donatrice, che deve possedere il fattore F, grazie al quale riesce a trasferire alla cellula ricevente i geni che le mancano per diventare una cellula prototrofa.

Per dimostrare che questa non era una trasformazione batterica, si usò un tubo ad U mettendo da una parte un ceppo donatore e dall’altro il ceppo ricevente, con in mezzo un filtro che faceva passare la brodocoltura ma non le cellule, così si vide che la ricombinazione non avveniva se non c’era un contatto fisico fra le due cellule.