Replicazione dei virus – seconda fase

Seconda tappa: la penetrazione-uncoating (che significa perdere il rivestimento)

Questa tappa, a differenza della prima, richiede un contributo attivo della cellula, quindi può avvenire solo nelle cellule vitali e metabolicamente attive (a circa 37° C). Anche in questo caso il virus sfrutta delle funzioni della cellula, ed essenzialmente sono due le modalità con cui il virus può entrare nella cellula, ovvero per endocitosi o per fusione con la membrana della cellula bersaglio. Entrambi i processi non sono specifici per l’interazione virus-cellula, l’endocitosi avviene normalmente per introdurre del materiale esogeno, così come la fusione è un processo che la cellula utilizza per fare fondere le vescicole o per spostare del materiale sulla membrana cellulare. In linea di massima possiamo dire che i virus con l’envelope entrano nella cellula grazie alla fusione tra l’envelope e la membrana cellulare. Alcuni di questi virus però, prima della fusione, entrano nella cellula mediante l’endocitosi, e la fusione avviene successivamente tra l’envelope e la membrana della vescicola endocitata. La maggioranza dei virus nudi entrano invece per endocitosi, solo qualche particolare virus ha un fenomeno simile alla fusione, che è comunque parziale e non completo, essendo questi virus dotati di un capside e non di una struttura simile alla membrana cellulare, come invece è l’envelope.

Il meccanismo di fusione

Il virus innanzitutto si deve essere legato ai recettori presenti sulla membrana della cellula bersaglio, questa interazione modifica così l’antirecettore, portando a fare sì che il virus si avvicini sempre di più alla membrana citoplasmatica, cioè lo spazio che separa i due doppi strati lipidici si riduce sempre di più, finché vengono in contatto e si fondono tra loro, in questo caso l’envelope va quindi a formare un pezzetto aggiuntivo alla membrana cellulare della cellula bersaglio. Questo fenomeno deve avvenire solo dopo che il virus si è legato al recettore cellulare, per prevenire innanzitutto che le particelle virali si fondano tra di loro ed anche per evitare la fusione dell’envelope con le cellule che non rappresentano il bersaglio del virus, pertanto ci sono dei sistemi di controllo per cui la fusione è attivata solo dopo l’interazione recettore-antirecettore, la fusione è infatti mediata da un proteina di fusione che si trova sulla superficie del virus, che in condizioni normali non è funzionante e quindi non determina una fusione.

Ci sono delle proteine fusogene pH dipendenti (si attivano cioè ad un valore di pH acido) e pH indipendenti (si attivano cioè ad un valore di pH neutro), questo condiziona il fatto che ci siano dei virus che fondono a livello della membrana della vescicola di endocitosi, ed altri che fondono a livello del plasmalemma. Nel caso delle proteine fusogene che regolano la fusione dell’envelope con la membrana dell’endosoma, l’attivazione si ha a un valore di pH acido, infatti la vescicola di endocitosi per sua natura viene acidificata in quanto vengono pompati dei protoni al suo interno ed il pH scende ad un valore di 6,5, per poi abbassarsi ulteriormente dopo la fusione con il lisosoma. Nel secondo caso invece la proteina fusogena non richiede l’acidificazione, perché a livello dei liquidi interstiziali il pH è neutro e queste sono delle proteine pH indipendenti. In questo caso l’attivazione della proteina fusogena, che può essere la stessa proteina antirecettoriale che ha anche una funzione fusogena, oppure può essere un’altra proteina, avviene indipendentemente dal pH. Il legame tra il recettore e l’antirecettore determina una modifica conformazionale dell’antirecettore che fa sì che venga esposta una porzione di proteina fusogena, chiamata peptide di fusione, una sequenza di amminoacidi altamente idrofobici che possono affondarsi nel doppio strato lipidico della cellula. Quindi il meccanismo di controllo che previene la fusione aspecifica, è il fatto che il peptide di fusione normalmente non è esposto, e viene reso disponibile solo dopo l’interazione tra l’antirecettore e il recettore.

Nell’immagine a fianco è rappresentato ciò che succede per il virus dell’HIV, dove inizialmente la proteina Gp120 (che rappresenta la proteina recettoriale) maschera la proteina Gp41 (che rappresenta la proteina fusogena). Il legame della proteina Gp120 prima con la molecola CD4 e poi con il corecettore (che può essere il CCR-5 o il CXCR-4) modifica la conformazione della proteina Gp120 in modo che la proteina Gp41 si trovi ora esposta, così il peptide di fusione può reagire con il doppio strato fosfolipidico della cellula bersaglio.

 

I virus nudi

Parliamo ora dei virus nudi, privi di envelope: quasi tutti i virus nudi entrano nella cellula per endocitosi, l’interazione recettore-antirecettore determina infatti l’attivazione dell’endocitosi di tali virus, si forma così una vescicola rivestita da clatrina che va poi incontro ad un’acidificazione all’interno della cellula.

L’endosoma ha vari stadi evolutivi, dall’endosoma precoce diviene infatti un endosoma tardivo, subendo subito un’acidificazione.

Per i virus nudi l’acidificazione dell’endosoma è fondamentale affinché avvenga la tappa successiva del loro ciclo, l’uncoating, vale a dire la completa perdita da parte del virus di tutti i suoi rivestimenti (il capside), senza la quale non potrebbe esserci l’espressione, la trascrizione e la duplicazione dell’acido nucleico virale.

La tappa della spoliazione (o uncoating) può essere precoce, avviene cioè quasi in contemporanea con l’ingresso del virus, o tardiva.

Uncoating dei virus a DNA 

Solitamente i virus a DNA sono caratterizzati da una spoliazione tardiva, cerchiamo di capirne ora il perché: i virus a DNA si replicano nel nucleo, pertanto dovranno porsi il problema di attraversare la membrana nucleare, è importante, al fine della buona riuscita di questo attraversamento, che l’acido nucleico sia protetto più a lungo. La loro spoliazione sarà tardiva, di conseguenza il capside rimane intatto generalmente fino ai pori nucleari.

Prima di entrare nel nucleo la disgregazione del capside dei virus a DNA sarà soltanto parziale, in quanto alcune proteine si disassemblano, ma altre permangono, giocando un ruolo cruciale nell’entrata del virus nel nucleo.

L’importanza dell’acidificazione per l’uncoating è dimostrata trattando le cellule infettate con la bactilomicina A, in quanto è una sostanza che inibisce l’acidificazione dell’endosoma. In questo modo si blocca il ciclo replicativo virale dei virus nudi che entrano per endocitosi.

L’acidificazione dell’endosoma, con la perdita di alcune proteine del capside, permette la modificazione della permeabilità di membrana dell’endosoma.

Un esempio è l’adenovirus: esso è un virus nudo e facilmente riconoscibile per la peculiarità della sua struttura icosaedrica, inoltre presenta dei prolungamenti che si dipartono dai suoi vertici, le cosiddette fibre del pentone. La fibra rappresenta la proteina antirecettoriale del virus che si lega a CAR (coxachiaevirus-adenovirus receptor), il suo recettore, è richiesto inoltre un corecettore.

Il legame fibra-recettore-corecettore determina l’attivazione della formazione della vescicola di endocitosi, all’interno della quale la proteina della fibra viene persa, poi con l’acidificazione anche le altre proteine vengono perse.

Le proteine rilasciate dal capside hanno un’azione tossica molto importante, infatti se trattiamo alcune cellule con queste proteine, anche senza il contatto delle cellule col virus vero e proprio (che è dotato dell’acido nucleico), esse andranno incontro alla morte. Capiamo così come queste proteine abbiano un’azione tossica intrinseca, indipendente dall’acido nucleico virale e dalla sua replicazione.

È fondamentale sapere che le proteine rilasciate dal capside sono capaci di alterare la permeabilità dell’endosoma e di garantire la fuoriuscita del capside parzialmente digerito, contenente l’acido nucleico virale, che raggiungerà poi i pori nucleari.

Solitamente i virus a DNA, che devono andare nel nucleo, una volta fuoriusciti dall’endosoma, raggiungono la membrana nucleare tramite le fibre del citoscheletro, che agganciano il capside parzialmente digerito e tramite i loro meccanismi di allungamento-accorciamento portano il virus sulla membrana nucleare.

Solitamente per l’uncoating non è richiesto l’intervento dei lisosomi, la fuoriuscita del capside parzialmente digerito dall’endosoma deve avvenire prima della fusione dell’endosoma con il lisosoma, poiché gli enzimi lisosomiali potrebbero portare ad una completa digestione della particella virale, tra gli enzimi lisosomiali ci sono infatti le nucleasi, le DNAsi e le RNAsi, che porterebbero alla digestione addirittura dell’acido nucleico virale.

 

Ciclo litico e abortivo

Il fatto che il virus incontri una cellula che esprime i giusti recettori e riesca a produrre una progenie virale è un particolare tipo di relazione che prende il nome di ciclo litico.

Le cellule in cui un virus può portare a termine il ciclo litico, quindi produrre una progenie (o ciclo produttivo), sono definite cellule permissive, che non sono la stessa cosa delle cellule sensibili, che sono quelle che avendo i recettori per un determinato virus permettono a questo di legarsi ed eventualmente di entrare e replicarsi, ma questo può anche non avvenire.

Non è detto che una cellula sia al tempo stesso sensibile e permissiva, ma ci sono anche le due situazioni limite:

  • cellula sensibile, che quindi ha i recettori, ma non è permissiva
  • cellula permissiva, che però non ha i recettori, ma ci sono casi in cui il virus riesce ad entrare comunque e se appunto la cellula è permissiva riesce a compiere un ciclo produttivo.

Il ciclo produttivo può causare dei seri danni alla cellula, nel caso dei virus citopatici, e questo può anche portare a morte la cellula (si parla di un virus citocida), oppure possiamo avere un ciclo replicativo che danneggia pochissimo la cellula e che è compatibile con la vita di quest’ultima, in questo caso il virus continua per moltissimo tempo a replicarsi dando vita ad un’infezione cronica.

Se la cellula ha i recettori e consente l’ingresso del virus, ma non è permissiva, il virus non potrà portare a termine il ciclo produttivo e in questo caso parleremo di ciclo abortivo, cioè il virus compie le prime tappe, a volte anche la replicazione, ma non ci sarà la produzione di nuove particelle virali, quindi parleremo di ciclo non produttivo in una cellula non permissiva.

In alcuni casi il ciclo abortivo può essere privo di conseguenze, quindi il virus entra, ma l’acido nucleico viene degradato, in altri casi invece anche il ciclo abortivo porta dei danni alla cellula o comunque delle alterazioni, ad esempio il virus può esprimere alcune proteine (soprattutto precoci) senza arrivare alla completa replicazione dell’acido nucleico con la formazione di nuove particelle virali, però queste proteine possono scatenare una risposta immunitaria nei confronti della cellula che verrà distrutta dal sistema immunitario, oppure questa trascrizione precoce può causare dei danni alla cellula ed andare incontro ad una sofferenza. Se si tratta di un virus oncogeno le proteine precoci possono causare la trasformazione tumorale della cellula (ma questo lo studieremo meglio più avanti).

Le proteine virioniche possono essere di per sé tossiche, come abbiamo visto per la proteina della fibra degli adenovirus, che è una proteina estremamente tossica, quindi una cellula non permissiva contaminata da un adenovirus può andare incontro alla morte per tossicità.

Rotavirus

C’è però un’eccezione a questa regola, rappresentata dai reovirus, una famiglia di virus davvero importante, che comprende numerosi elementi non patogeni per l’uomo, ma anche altri molto patogeni, ad esempio i rotavirus, che creano dei seri problemi intestinali, soprattutto nei bambini.

La peculiarità dei rotavirus sta nel possedere due capsidi, uno dentro l’altro, che li rende molto resistenti, capaci di permanere per lungo tempo nell’ambiente, nell’acqua o negli alimenti.

Per digerire questo doppio capside estremamente resistente è richiesto l’intervento degli enzimi lisosomiali ed il rilascio nel citoplasma avviene tardivamente, perché il capside esterno deve essere completamente digerito dalle proteasi lisosomiali.

Picornavirus

Alcuni virus nudi entrano con una modalità particolare che ricorda la fusione, che abbiamo visto nelle scorse lezioni essere propria dei virus con l’envelope. Anche in questo caso c’è una proteina con una componente idrofobica, data da un peptide di fusione, che entra in gioco per permettere l’ingresso del virus.

Stiamo parlando della famiglia dei Picornavirus, dei virus nudi a simmetria icosaedrica, tra cui il molto conosciuto poliovirus, l’agente eziologico della poliomielite.

Il recettore cellulare per questa famiglia di virus si chiama PVR (polio-virus receptor), VP1 è invece l’antirecettore virale, in particolare il legame tra PVR e VP1 provoca la comparsa di cambiamenti nelle proteine capsidiche. I Picornavirus hanno, in particolare, 4 proteine capsidiche, VP1, VP2 e VP3 che sono collocate sulla superficie esterna del capside, mentre VP4 è rivolta all’interno.

L’interazione VP1-PVR determina il distacco della VP4 ed un cambiamento della struttura di VP1 stesso. In seguito a questo legame, infatti, una porzione idrofobica della catena amminoacidica del VP1, che normalmente è rivolta verso l’interno, si ribalta e va ad affondarsi nel doppio strato lipidico della membrana plasmatica, questa porzione di VP1 rappresenta il peptide di fusione e forma una specie di canale attraverso il quale passa il RNA virale. È chiaro che non stiamo parlando di una fusione completa, che avviene solo nei virus con l’envelope, ma parziale, dato che il capside, essendo completamente costituito da proteine, non può diventare una porzione di membrana.