Replicazione dei virus a DNA

Una volta entrato il DNA nella cellula (esso deve raggiungere il nucleo e l’uncoating sarà di conseguenza tardivo), esso viene trascritto solo parzialmente. Stiamo parlando della trascrizione primaria, che si occupa soltanto della formazione delle proteine primarie, che sono funzionali, enzimatiche, non le ritroveremo nella particella virale matura e servono alla duplicazione del DNA virale.

L’evento successivo alla trascrizione primaria è quindi la duplicazione del DNA con la formazione di nuove molecole, a stampo delle quali vengono trascritti gli altri geni, detti tardivi, che codificano per le proteine strutturali, quindi del capside, della matrice e dell’envelope.

Tra la fase delle proteine primarie e la fase di quelle tardive è interposta una fase di sintesi del DNA virale.

Parvovirus

I Parvovirus, della seconda classe, hanno un genoma piccolissimo, di solo 4 kilobasi, poco più di 4.000 nucleotidi e due geni, uno per le proteine funzionali ed uno per quelle strutturali. I Parvovirus sono talmente semplici che non solo non hanno una propria DNA polimerasi (e quindi devono usare quella cellulare), ma non hanno nemmeno delle molecole in grado di interagire col ciclo della cellula ospite.

La cellula, chiaramente, esprime la DNA polimerasi non sempre, ma soltanto durante la fase S, quindi il virus se vuole giovarsi della DNA polimerasi cellulare deve perlomeno essere in grado di mandare la cellula in fase S, modificando il ciclo cellulare.

I Parvovirus non essendo in grado di fare ciò, possono replicarsi solo in popolazioni cellulari attivamente proliferanti e non in cellule quiescenti.

Il virus B19 è in grado di infettare solo le cellule della linea rossa del sangue, per via di un recettore specifico che queste cellule possiedono, e può replicarsi solo nei progenitori midollari dei globuli rossi, come gli eritroblasti, perché queste sono le cellule in proliferazione, quindi esprimono la DNA polimerasi.

SV40

Per quanto riguarda la prima classe, SV40 (ha un genoma di circa 5 kbasi), un virus della scimmia, appartiene alla famiglia Papovaviridae. E’ stato il primo virus il cui genoma sia stato interamente mappato e sequenziato ed è stato il primo virus ad essere utilizzato come vettore per introdurre nella cellula del materiale esogeno.

Ne parliamo perché ha un meccanismo di replicazione del DNA del tutto simile a quello della cellula, seppur in piccolo.

Il DNA del SV40 è circolare, double strand, superavvolto ad elica, associato a delle proteine istoniche e utilizza degli enzimi come la topoisomerasi, proprio come il DNA cellulare.

Il virus SV40 è anche considerato un prototipo dei virus oncogeni a DNA.

Nell’inizio del genoma c’è una regione detta Ori che rappresenta sia l’inizio della trascrizione che l’inizio della duplicazione della molecola.

Nel genoma ci saranno, come in tutti i virus a DNA, dei geni precoci e dei geni tardivi.

I primi vengono trascritti in senso antiorario, i secondi in senso orario.

I geni precoci sono due, l’antigene T grande e l’antigene t piccolo, in particolare “T” sta per tumore perché le cellule che per effetto del virus diventano tumorali esprimono sulla superficie questa proteina.

C’è una fortissima sovrapposizione di geni, il gene t piccolo è quasi interamente sovrapposto al gene T grande ed il codone di inizio dei due geni è lo stesso.

T grande è una proteina importantissima, è il più potente promotore della trascrizione virale ed ha una funzione regolatoria anche nei confronti della propria trascrizione precoce, a basse concentrazioni promuove la propria trascrizione, ad alte concentrazioni la inibisce.

T grande regola anche la trascrizione dei geni tardivi, che avviene dopo la duplicazione, è anche in grado di promuovere la trascrizione di geni cellulari, sa quindi legarsi, in corrispondenza di Ori, al DNA virale, ma anche al DNA cellulare, ovviamente per promuovere la trascrizione di geni che servono al virus e non alla cellula.

L’antigene T grande è capace di influenzare fortemente il ciclo cellulare, interagendo con la proteina p53 e con Rb, che sono i prodotti di geni oncosoppressori e servono a controllare la replicazione cellulare, forzando il ciclo cellulare verso la fase S, nella quale è prodotta la DNA polimerasi che serve al virus.

Una volta prodotta la DNA polimerasi, può dunque avere inizio la duplicazione del DNA virale, che inizia in corrispondenza di Ori, ed è interamente regolata da T grande.

Su Ori la DNA polimerasi si attacca e si formano due forcelle replicative, come accade per il DNA cellulare, queste procedono in direzione opposta mentre il DNA viene duplicato, fino a ricongiungersi all’estremo opposto.

Ci si trova così a dover risolvere il problema delle tensioni generate dal superavvolgimento: le topoisomerasi servono appunto a svolgerlo, cosicché le due forcelle possano procedere senza difficoltà, in entrambe le direzioni.

In direzione 5′-3′ il filamento è sintetizzato in maniera continua, mentre nell’altra direzione è sintetizzato a frammenti (si parla dei frammenti di Okazaki), uniti da una DNA ligasi cellulare, indotta anch’essa dal virus nella cellula.

Alla fine otteniamo due nuove molecole di DNA double strand, il problema però è che le due catene formatesi saranno intrecciate tra loro, essendo il genoma di questi virus un anello continuo, interviene allora di nuovo la topoisomerasi II che opera un nick, un taglio, separandole.

Può così iniziare la trascrizione tardiva, che avviene in senso orario, ed è sempre regolata da T grande, con la formazione di tre proteine capsidiche: VP1 (che è la più grande e la più importante), VP2 e VP3. Anche i geni tardivi hanno una sovrapposizione, VP2 e VP3 sono quasi completamente sovrapposte, sono trascritte in frame per cui hanno una sequenza identica. Per VP1 la sintesi non è in frame, ma inizia dalla seconda o terza lettera del codone, quindi tutto il messaggio è sfasato e la sequenza è completamente diversa.

Oltre a queste è sintetizzata anche una proteina non capsidica, LP1, che favorisce l’assemblaggio delle proteine virali e anche la traslocazione degli mRNA virali dal nucleo al citoplasma.

Questo avvantaggia quindi la sintesi delle proteine virali rispetto alla sintesi delle proteine cellulari.

Adenovirus

Gli Adenovirus (hanno un genoma di circa 30-35 kbasi) sono un altro esempio di virus a DNA della prima classe, hanno diametro intorno a 90 nm e codificano per circa 10 proteine capsidiche, inoltre presentano le fibre del pentone ai vertici del capside.

Hanno un DNA double strand lineare, non circolare, e presentano agli estremi del genoma delle sequenze ripetute ed invertite, quindi palindromiche. Quando ci sono queste sequenze palindromiche bisogna aspettarsi che ad un certo punto del loro ciclo replicativo si abbia una circolarizzazione, o almeno un appaiamento di queste sequenze, che sono fatte apposta per questo scopo.

Gli adenovirus hanno 4 geni precoci: E1, E2, E3 ed E4, con E1 che è diviso in E1A ed E1B, mentre E2 è diviso in E2A ed E2B.

Ci sono anche 5 geni tardivi, che vanno da L1 a L5.

I geni precoci non danno origine a 6 proteine soltanto, perché non sono proprio dei geni, ma delle “open reading frame” (o ORF), ciascuna di queste sequenze infatti può essere trascritta in maniera diversa, con splicing diversi, e dare quindi origine a più di una proteina.

Ricordiamo ora l’importanza di T grande: in questi virus E1A codifica per 5 diverse proteine, che, svolgono la funzione dell’antigene T grande per il virus SV40, hanno un ruolo cruciale nel controllare la replicazione virale.

I prodotti di E1A, quindi, a basse concentrazioni promuovono fortemente la propria trascrizione (è un meccanismo a feedback positivo) ed anche la trascrizione di tutti gli altri geni precoci, che codificano per le proteine che servono per la replicazione cellulare.

All’aumentare della concentrazione di E1A però prevale un’azione inibitoria sulla trascrizione precoce (è un feedback negativo), perché conviene che il virus, quando ha già molte proteine precoci, quindi funzionali, inizi a sintetizzare le proteine strutturali, che servono in grandissima quantità.

Il virus ha infatti bisogno di poche copie di proteine funzionali, enzimatiche, ma di molte copie di proteine strutturali.

E1A ha anche la capacità di promuovere la trascrizione di molti geni tardivi, tutti quelli che hanno delle TATA box.

A questo punto il virus è pronto ad iniziare la duplicazione del DNA, senza bisogno che la cellula vada in fase S, perché gli adenovirus codificano per una propria DNA polimerasi, che è uno dei prodotti del gene E2B.

I geni precoci codificano anche per il precursore della proteina terminale, che abbiamo visto essere legata al 5’ del genoma del adenovirus.

Questo precursore si lega a un nucleotide citosinico, ad una serina e il complesso va a legarsi al 3′ di ciascuno dei due filamenti del DNA.

Il complesso polimerasi-precursore della proteina-serina funziona da primer e fa iniziare la duplicazione di uno dei due filamenti, man mano che la polimerasi procede nella duplicazione di un filamento, l’altro filamento si stacca.

Per evitare che il filamento che si sta spaiando (gli acidi nucleici a singolo filamento sono estremamente fragili e facilmente vengono attaccati dalle DNAsi e degradati) venga degradato, è immediatamente rivestito da una proteina DNA binding protein codificata dal gene E2A del virus.

Negli estremi della molecola, come accennato prima, troviamo le sequenze palindromiche, queste si appaiano in una struttura detta a manico di padella, mentre tutto il resto del filamento è a singolo filamento e rivestito dalla DNA binding protein. Nel frattempo si completa la duplicazione del primo filamento.

Quindi tutti e due i filamenti del DNA parentale del virus vengono duplicati, ma con strategie diverse.

La DNA polimerasi inizia quindi la duplicazione del secondo filamento proprio a partire dal manico di padella e mano a mano che procede, stacca la DNA binding protein.

Tutti e due i filamenti sintetizzati faranno poi da stampo per la sintesi di altri filamenti, in un processo ciclico e continuo che porta alla produzione di grandi quantità di  nuove molecole.

A partire dalle molecole neosintetizzate avviene, come sempre, la trascrizione dei geni tardivi, con la conseguente formazione delle proteine strutturali.