Plasmide F

Il Fattore F è il plasmide più piccolo tra quelli coniugativi, perché esprime quasi esclusivamente le potenzialità di coniugare un’altra cellula batterica, in particolare chi ha questo fattore F, ovvero le cellule F+, sono capaci di trasferire questo fattore alle cellule riceventi F-, che così diventano anche loro delle cellule F+, questa è la prima modalità di passaggio del fattore F.

L’acido nucleico del Fattore F o del plasmide F contiene:

  • Geni TRA, che servono per codificare il meccanismo di trasferimento
  • Un punto oriT, che rappresenta l’origine del trasferimento
  • Delle sequenze d’inserzione che permetteranno al plasmide di andare a localizzarsi sul cromosoma della cellula batterica ricevente, andando a localizzarsi in punti di omologia, che solitamente sono 4 o 5. Così questa sequenza nucleotidica passa allo stadio episomico, cioè arriva ad interagire su una sequenza omologa del cromosoma del ricevente, dando vita ad una cellula HFR (High Frequency of Recombination).

Quando una cellula F+, incontra una cellula F-, la cellula ricevente diventa al 100 % una cellula F+, quindi ora ha un’infettività elevatissima. Tutto questo dipende proprio dalla struttura del fattore F, che codifica per:

  1. La produzione di pili F (1 o al massimo 2)
  2. L’autoreplicazione del fattore F
  3. L’autotrasferibilità del fattore F, che sfrutta il meccanismo di autoreplicazione, quindi il meccanismo del cerchio rotante, che fa sì che una delle 2 eliche dell’acido nucleico plasmidico venga a tagliarsi nella posizione oriT, poi da lì, partendo dalla posizione 5’, questo acido nucleico passerà nella cellula ricevente con un meccanismo di cerchio rotante. Il plasmide ruotando in senso orario, fa srotolare le due eliche, poi quella con l’estremità 5’ passa nella cellula ricevente, e mentre ruota si replica l’elica complementare, così che alla fine della rotazione di 360°, le due eliche si sono replicate e completamente separate, quindi la cellula ricevente acquisisce un plasmide identico a quello della cellula donatrice, nella quale rimane l’altra copia.

Questo è il processo generale, ma allo stesso tempo alcuni autori sostengono che il fattore F sia un po’ più lungo nella cellula ricevente, e le estremità di questo fattore F debbano permettere poi la chiusura del cerchio.

Tutto questo processo è condizionato dal pilo F, perché la cellula donatrice mette in atto il meccanismo di autoreplicazione ed autotrasferibilità solo quando riceve il segnale del contatto del pilo F con la cellula ricevente. Secondo alcuni autori invece l’elica di DNA passa all’interno del pilo, anche se sembra che il pilo non abbia un diametro sufficientemente grande per farla passare, quindi altri autori sostengono che si formi un ponte protoplasmatico, cioè una soluzione di continuità tra le due cellule, che permetta il passaggio del mio plasmide, in ogni caso se una cellula non possiede il pilo, non può dar luogo al fenomeno di coniugazione, ad esempio se il pilo viene staccato accidentalmente, la cellula non può tornare a coniugare finchè questo pilo non ricresce.

Teniamo in considerazione anche che con la stessa frequenza con cui si acquisisce il fattore F, così esso si può perdere, ad esempio per invecchiamento o per l’esposizione a sostanze particolari, come le sostanze mutagene.

Abbiamo anche una seconda modalità di passaggio del plasmide, ovvero del fattore F: questo fattore F si può localizzare in posizione episomica, cioè sul cromosoma del batterio in una posizione di omologia (ci sono infatti delle sequenze d’inserzione identiche all’interno del cromosoma batterico che sono uguali alle sequenze d’inserzione del fattore F, ad esempio per il Escherichia coli ci sono almeno 3 punti in cui questo fattore F può andarsi a localizzare). Anche sul cromosoma rimane intatta la sua capacità di replicarsi autonomamente, cioè di autotrasferirsi, quindi se questo batterio entra in contatto con una cellula ricevente, scatena il meccanismo del trasferimento. OriT, ovvero la posizione in cui si rompe l’elica del plasmide, che poi passa nella cellula ricevente, si trova il più delle volte all’interno del fattore F, così esso viene diviso in due parti. Quindi per venire trasferito tutto il fattore F, cioè anche la seconda parte, deve essere trasferito anche tutto il cromosoma batterico che è posto in mezzo, bisogna fare tutto il giro della sequenza di DNA batterica per tornare al trasferimento di quello che manca del fattore F. In condizioni normali non è possibile far passare tutto il cromosoma batterico, perché il ponte protoplasmatico si ritrae in tempi brevi, sufficienti solo per permettere il passaggio di una parte del fattore F e di una parte del cromosoma batterico, se volessimo far passare tutto il cromosoma batterico impiegheremmo molto di più, circa 90 minuti. Nonostante ciò, in laboratorio questo può essere possibile, mantenendo le cellule a contatto: così facendo ed interrompendo in momenti diversi il trasferimento del cromosoma, registrando i fenomeni fenotipici sulla cellula ricevente, si è riusciti a vedere nella cellula ricevente quali geni passavano, e quindi si è riusciti a caratterizzare la sequenza genica del cromosoma del Escherichia coli. Questa cellula, ricevente una porzione del fattore F ed una porzione dei geni del cromosoma batterico, si chiama HFR (High Frequency of Recombination), perché ha un’elevata percentuale di ricombinazione, permette infatti la ricombinazione del materiale genetico che gli è stato donato da una cellula F+, in quanto il fattore F ha delle sequenze d’inserzione uguali ad alcune sequenze presenti nel cromosoma batterico, che gli permettono d’inserirsi. Nonostante però in questo caso la cellula HFR sia una cellula ricevente, rimane F- perché non riceve completamente il fattore F.

Esiste infine una terza possibilità di passaggio del fattore F, in particolare si parla di excisione del fattore F, che ritorna dal livello cromosomico al livello plasmidico. Questa modalità avviene ai margini del fattore F, così la cellula da HFR ritorna una cellula F+. A volte avvengono delle excisioni aberranti, con le quali una sequenza di cromosoma viene trasportata sul plasmide. Questo meccanismo si chiama F-duzione, e crea un plasmide ibrido, la cui cellula ora si chiama F’. La cellula F’ tramite il processo di coniugazione può trasferire ora il plasmide ad una cellula ricevente, che acquisisce così anche la sequenza genica staccata dal cromosoma della cellula donatrice. Di questo fenomeno ce ne siamo accorti casualmente in un’epidemia di salmonella in Brasile, dove accadde che dei bambini affetti da gastroenterite vennero analizzati con la coprocoltura, che è la tecnica microbiologica di analisi delle feci, che consente l’individuazione dei microrganismi patogeni nelle feci degli individui analizzati, ma non si riuscì a mettere in evidenza la salmonella. Per l’isolamento degli enterobatteri (ovvero presenti nell’intestino) patogeni abbiamo così utilizzato un terreno chiamato Agar-MacConkey, un terreno selettivo differenziale, ovvero selettivo perché è addizionato con dei sali biliari che impediscono lo sviluppo dei batteri Gram+, mentre è differenziale perché è addizionato anche con il lattosio ed un indicatore di pH. Questo terreno, quindi, seleziona unicamente i batteri Gram-, ma in particolare all’interno dei batteri Gram- noi vogliamo mettere in evidenza la capacità o meno di fermentare il lattosio, che è addizionato al terreno. E’ importante tutto questo perchè i patogeni intestinali, in particolare la salmonella e la shigella, non fermentano il lattosio, allora tra tutte le colonie che cresceranno bisogna andare ad individuare quelle che non fermentano il lattosio, le quali hanno un colore diverso da quelle in cui avviene questa fermentazione, perché essa provoca un abbassamento di pH e quindi una variazione del colore dell’indicatore che fa diventare le colonie fermentanti di un colore rosso vinaccia, mentre le colonie non fermentanti rimangono grigie, questo ci permette dunque d’individuare sulla piastra la potenziale presenza di batteri patogeni. Ebbene, nelle coprocolture di questi bambini non si erano mai visti dei batteri non fermentanti il lattosio, tutte le colonie che si sviluppavano erano infatti di colore vinaccia. Questo voleva dire che probabilmente non avevano la salmonella, quindi le piastre venivano eliminate, come accadeva in tutti i laboratori quando ad una coprocoltura non si evidenziavano i batteri patogeni. Invece era successo un fenomeno diverso, ovvero il gene Lac, che è posto su un punto preciso del cromosoma dell’Escherichia coli, è molto vicino a uno di quei punti di omologia in cui si va a collocare il fattore F, attraverso una sequenza d’inserzione, poi staccandosi il fattore F per tornare a livello plasmidico, aveva portato via proprio il gene codificante per la fermentazione del lattosio, così il plasmide che questo Escherichia coli metteva in evidenza, conteneva il gene Lac, perché aveva staccato il gene dal cromosoma batterico e lo aveva portato sul plasmide. Quindi, in questo esempio, l’Escherichia coli era la cellula F’. Allora con molta probabilità le salmonelle di quei bambini avevano acquisito per ricombinazione da questo Escherichia coli il gene codificante per la fermentazione del lattosio, di conseguenza quelle salmonelle, quando si sviluppavano sul terreno di Agar-MacConkey, si mascheravano come Escherichia coli, perché producevano delle colonie fermentanti il lattosio, che erano impossibili da riconoscere immediatamente, perché avevano lo stesso aspetto delle colonie fermentanti il lattosio di Escherichia coli.

Riassumendo esistono tre modalità di passaggio del fattore F:

  1. La cellula F+, contenente il fattore F, attua una coniugazione con una cellula ricevente F-, la quale riceve il fattore F diventando a sua volta una cellula F+
  2. Il fattore F si localizza in posizione episomica, poi quando questa cellula effettua la coniugazione, trasmette una porzione del fattore F e dei geni del suo cromosoma, trasformando la cellula ricevente in una cellula HFR
  3. L’excisione (o escissione) del fattore F, che ritorna a livello plasmidico, mentre se si verificano delle excisioni aberranti, la cellula diventa F’

 

L’antibiogramma

Rappresenta il risultato di un’analisi batteriologica, in cui la semina di un batterio viene fatta per valutarne la sua sensibilità ad un antibiotico. In particolare si semina il batterio sulla piastra, poi si posizionano sempre all’interno della piastra dei dischetti imbibiti con un antibiotico, se l’alone d’inibizione intorno al dischetto supera una certa misura vuol dire che l’antibiotico è efficace, quindi il batterio non possiede la resistenza a questo batterio.

La MIC (Minimum Inhibitory Concentration)

E’ la più bassa concentrazione di antibiotico che è in grado d’inibire una crescita palese del batterio, cioè se si osserva la provetta e la soluzione contenente il batterio, non è torbida. Ci sono una serie di provette che contengono un brodo colturale, a cui è stato addizionato dell’antibiotico a concentrazioni al raddoppio (1-2-4-8-16-32-64-128-256-512 mg / ml), poi successivamente si aggiungono i batteri ad una concentrazione di 103 / ml, in modo che la provetta rimanga limpida anche col microrganismo seminato, il tutto viene incubato per 24 ore. Dopo aver effettuato una prova di controllo, osservo le provette e, partendo dalla concentrazione minima di antibiotico, la concentrazione di antibiotico della prima provetta che non mostra una palese crescita di batteri è definita come la MIC. Questa valutazione è molto importante in clinica per stabilire le dosi più adeguate, non eccessive, di antibiotici in una cura.

La Minima Concentrazione Battericida è invece la concentrazione in grado d’inibire il 99,9 % dei batteri dell’inoculo iniziale. Nella provetta indicata con la sigla MIC non ci sono zero batteri, perché la torpidità si appalesa quando la concentrazione dei batteri è superiore a 104 / ml. Se inoculo 104 batteri in una soluzione contenuta in una provetta, affinché essa sia anche una minima concentrazione battericida, bisogna avere in questa provetta (dopo il periodo d’incubazione) meno di 10 batteri / ml.