Maturazione dei virus

Le fasi terminali del ciclo di replicazione

A questo punto il virus ha prodotto le sue componenti strutturali e le nuove copie di genoma per formare i nuovi virioni.

L’assemblaggio

Le proteine capsidiche devono assemblarsi in modo da formare il capside, questo avviene in maniera diversa a seconda che si parli di un virus a simmetria elicoidale o icosaedrica.

Per la simmetria elicoidale si tratta di un processo che avviene in contemporanea alla replicazione del genoma.

I virus a simmetria elicoidale sono tutti virus ad RNA e sono tutti a singolo filamento, quindi è un genoma estremamente a rischio all’interno della cellula, che rischia di essere degradato in tempi brevissimi.

Quindi per questi virus via via che la catena si allunga si avvolge a formare un’elica che viene direttamente rivestita dalle proteine capsidiche, quindi i due processi avvengono in contemporanea.

Per quello che riguarda i virus a simmetria icosaedrica, si formano dei procapsidi vuoti nei quali entra l’acido nucleico, dopodiché avvengono le fasi terminali di maturazione delle proteine che sono soprattutto rappresentate da tagli proteolitici.

Questo fenomeno di assemblaggio delle proteine capsidiche è un fenomeno in larga parte spontaneo, regolato semplicemente dalla concentrazione delle proteine stesse, cioè quando all’interno della cellula, che è il sito di replicazione virale, si raggiunge un valore soglia di concentrazione di queste proteine, semplicemente si assemblano, e questa struttura così regolare, che è il capside, è quella termodinamicamente favorita, quindi trovandosi alla giusta concentrazione avremo un processo spontaneo.

In alcuni casi è un processo interamente spontaneo e non è necessaria nessuna componente, nè virale nè cellulare, che ne induca l’assemblaggio.

Ad esempio per quel che riguarda il virus del mosaico del tabacco si è visto che mettendo in una provetta la giusta concentrazione di proteine capsidiche (a pH e temperatura idonee) e senza nessun’altro componente, queste spontaneamente si associano dando luogo ai procapsidi, che rimangono ovviamente vuoti.

È cruciale, dunque, per dare avvio all’assemblaggio la concentrazione delle proteine, ma ci sono alcuni casi in cui i componenti virali vengono sintetizzati direttamente all’interno di una vescicola, questo è molto utile perché la molecola di acido nucleico viene protetta, inoltre si raggiunge più facilmente la concentrazione critica di proteine capsidiche necessaria all’assemblaggio.

Per i capsidi più semplici, come abbiamo già detto, questo è un processo totalmente spontaneo, in altri casi osserviamo l’intervento di alcune proteine che servono come aiuto nella formazione del capside, ma che poi vengono degradate, essenzialmente per una digestione proteolitica, quindi non le troviamo nel capside maturo.

Queste proteine possono essere o proteine di scaffolding (o d’impalcatura) oppure chaperonine.

Le proteine di scaffolding formano un’impalcatura attorno alla quale si vanno a collocare le proteine capsidiche, mentre le chaperonine servono per fare assumere alle proteine virali la corretta conformazione spaziale di modo che si trovino nella conformazione più corretta per interagire con le altre.

In molti casi le chaperonine sono delle proteine cellulari, mentre per i virus più complessi che hanno a disposizione un genoma più ampio si tratta di proteine virus-specifiche (come la proteina L-4) di circa 100 KDalton.

I capsidi a simmetria icosaedrica si formano come procapsidi e poi vengono modificati, fino a diventare dei capsidi definitivi, quindi in sostanza quello che succede è la formazione di sottoassemblaggi, quindi alcune proteine si assemblano fra loro, poi vari di questi elementi si uniscono fra loro fino a formare il capside definitivo.

La formazione di questi sottoassemblaggi comincia prima che le proteine abbiano subito tutte le modificazioni post-traduzionali.

Nell’immagine (sopra, al punto B) vediamo come si formano i primi sottoassemblaggi dei picornavirus, che come abbiamo già visto appartengono alla quarta classe replicativa, con il RNA a polarità positiva che viene tradotto come un’unica poliproteina che poi subisce i vari tagli.

Il capside dei picornavirus è formato da 4 proteine strutturali (da VP1 a VP4), ciascun capsomero è formato da queste quattro proteine con VP1, VP2 e VP3 che formano la parte esterna e VP4 forma la parte interna.

La formazione dei capsomeri inizia prima ancora che ci sia stato l’ultimo taglio proteolitico dei precursori, quindi il sottoassemblaggio avviene quando VP1 e VP3 sono già state tagliate e quindi sono già nella loro forma definitiva, mentre le altre due proteine sono ancora parte di un complesso che prende il nome di VP0. Quindi quello che succede è che i precursori legati a VP1 e VP3 si associano, e solo dopo si ha la formazione della proteina VP2, che rimane in superficie, e della proteina VP4 che invece va all’interno.

Dopo ognuna di queste subunità che si sono formate si associano fino a formare il capside definitivo. In altri casi è ancora più complesso, come per gli adenovirus, per i quali si ha l’aggregazione prima della proteina della fibra (sono 3 molecole) con la proteina che forma la base del pentone (formata 5 molecole), poi ci sarà l’assemblaggio con l’esone che si è formato prima per l’assemblaggio di tre proteine grazie alle chaperonine. Quindi è un meccanismo abbastanza complesso che avviene per tappe successive e che porta alla formazione dei capsidi icosaedrici prima in forma immatura, poi in forma definitiva.

La maturazione e la fuoriuscita delle nuove particelle virali

Per “maturazione” intendiamo quando la particella virale è in grado di infettare, cioè quando ha subito tutte quelle modificazioni per cui può andare ad infettare una nuova cellula.

In alcuni casi la maturazione precede la fuoriuscita, questo avviene per i virus nudi, i quali sono maturi quando il capside ha subito le ultime modifiche e quindi risulta maturo con all’interno l’acido nucleico.

Quindi per questi virus le nuove particelle risultano mature e di conseguenza infettanti quando sono ancora dentro la cellula, quindi se noi andiamo a lisare la cellula otteniamo una popolazione virale in grado di infettare le altre cellule.

Questo non vale per i virus con l’envelope, i quali hanno acquisito il capside, ma che per essere delle particelle infettanti richiedono l’acquisizione dell’envelope appunto.

In questo caso, cioè nella maggior parte dei casi (ma vedremo delle eccezioni), il processo di maturazione coincide con la fuoriuscita.

Nel processo di maturazione, come abbiamo visto sono molto importanti le proteasi, che tagliano i precursori delle proteine capsidiche, determinano la gestione delle proteine di scaffolding, quindi la maggior parte dei virus prevede l’intervento di proteasi nel proprio processo di maturazione.

Queste possono essere virus-specifiche, come abbiamo visto per i retrovirus (sono tra i prodotti di pol), che quindi saranno molto specifiche e riconosceranno con precisione i siti di taglio dei precursori delle proteine virali, in caso contrario possono essere delle proteine cellulari, quindi meno specifiche e di conseguenza viene richiesto un controllo sulla loro attività.

I retrovirus sono caratterizzati da un processo di maturazione estremamente tardivo, al contrario di quello che abbiamo visto per i virus nudi, i quali raggiungono la maturazione ancora prima della fuoriuscita, anche se vedremo questo può avvenire anche per alcuni virus con l’envelope.

Abbiamo visto che il gene gag codifica per le proteine nucleocapsidiche e per la proteina della matrice, mentre il gene pol codifica per la trascrittasi, l’integrasi e la proteasi.

Questi due geni vengono trascritti in un unico messaggero policistronico, che viene tradotto in una proteina di fusione che prende il nome di gag-pol. Quindi per effetto della traduzione si forma questa grossa poliproteina che contiene tutte le proteine virali, questa viene prodotta nel citoplasma e come vedremo guiderà tutto il processo di maturazione.

I virus che hanno l’envelope prima di fuoriuscire dalla cellula devono acquisire questo rivestimento, che non è altro che un pezzo di una membrana cellulare in cui le glicoproteine sono state sostituite dalle glicoproteine virali, le quali si dovranno andare a collocare sull’envelope.

Il virus acquisisce questo rivestimento durante un processo che prende il nome di gemmazione o budding, nel quale ha un ruolo cruciale la proteina della matrice.

Le glicoproteine virali che dovranno collocarsi sull’envelope vengono sintetizzate sui ribosomi del reticolo endoplasmatico rugoso e riversate nelle vescicole del reticolo, subiscono le modificazioni post-traduzionali, poi tramite il traffico di vescicole passano per l’apparato del Golgi, ed infine vengono collocate sulla membrana della cellula.

Quindi avremo la cellula con dei tratti specifici di membrana, particolarmente ricchi di colesterolo e di particolari sfingolipidi (o lipidi raft).

In corrispondenza di questi lipidi raft troveremo un’alta concentrazione di glicoproteine virali, perche le glicoproteine cellulari sono state spostate e sostituite da queste.

Nel citoplasma della cellula ovviamente sono state sintetizzate anche le proteine della matrice, che hanno una doppia affinità chimica: con un estremo hanno una forte affinità per i lipidi e le glicoproteine dell’envelope, quindi vengono attratte verso le regioni dove si sono accumulate le glicoproteine virali, l’altro estremo ha una forte affinità per le proteine capsidiche, quindi con questa parte funzionano da polo di attrazione per i capsidi che sono stati assemblati.

I capsidi dunque vengono attirati verso le zone della membrana dove si sono accumulate le glicoproteine dell’envelope, perché qui si sono accumulate le proteine della matrice che attirano le proteine capsidiche.

A questo livello si forma una tensione chimico-fisica sulla membrana che comincia a sporgere, si forma così una protuberanza che prende il nome di gemma da cui il nome dell’intero processo.

La gemma sporge sempre di più finché i due lembi non collabiscono e si stacca portandosi dietro il pezzo di membrana su cui si erano accumulati i glicolipidi virali.

Ovviamente trattandosi di strutture di natura lipidica i lembi si saldano e non si formano delle soluzioni di discontinuità.

Come si vede dalle immagini il processo di gemmazione può interessare ampi tratti di membrana e questo disturba la cellula perché abbiamo delle zone dove appunto non troviamo le glicoproteine cellulari, ma solo delle strutture virali.

Abbiamo lasciato in sospeso il HIV, per il quale abbiamo detto il processo di maturazione è molto tardivo. Al contrario di quello che avviene, ad esempio, nei virus influenzali, per i quali il processo di maturazione non è tardivo perché la matrice ed i capsidi si sono già formati e con il processo di gemmazione si assume l’envelope, per il HIV anche la formazione della matrice e del capside avviene durante il processo di gemmazione.

Quello che succede è che sulla membrana citoplasmatica si sono accumulate le proteine dell’envelope, che sono codificate dal gene env, mentre la poliproteina gag-pol non è ancora stata clivata e comincia a mediare il budding quando è ancora in questa forma.

Con quello che è l’estremità della proteina gag prende rapporto con le glicoproteine dell’envelope, questa infatti è quella porzione che, una volta clivata, darà origine alla matrice, quindi alla parte più esterna, poi troviamo le altre proteine che fanno parte di gag, esternamente le proteine capsidiche e più internamente le proteine del nucleocapside, cioè quelle che si trovano a stretto contatto con il RNA.

Ancora attaccato a gag troviamo pol, che contiene la proteasi, la trascrittasi e l’integrasi, in seguito pol prenderà rapporto con il RNA virale attraverso quella parte che diventerà la trascrittasi inversa. Quindi vediamo che questa proteina gag-pol con un estremo prende rapporto con le glicoproteine dell’envelope, mentre con l’altra si lega al RNA. In questa fase comincia la gemmazione, quando abbiamo ancora la proteina in uno stato di precursore.

A questo punto la porzione proteasica di gag-pol ha una funzione auto-tagliante e taglia se stessa, quindi durante il processo di gemmazione o addirittura quando la gemma si è già staccata la poliproteina gag-pol viene tagliata e si formano la matrice, il capside, il nucleocapside e gli enzimi virali.