Incubazione dei batteri

  • Batteri anaerobi

Per ottenere un ambiente anaerobio si utilizza il gas-pak, un contenitore cilindrico con una chiusura stagna nel quale si vanno a posizionare delle piastre in cui abbiamo seminato il batterio anaerobio. Poi ci sono delle bustine che possono essere di diversi tipi: alcune una volta aperte reagiscono con l’ossigeno e lo eliminano, altre producono della co2 che ancora una volta elimina l’ossigeno, tutto questo serve per creare l’assenza di ossigeno perché i batteri anaerobi non sono forniti di alcuni enzimi necessari per eliminare le sostanze per loro tossiche come l’ossigeno.

  • Microaerofili

Sono dei microrganismi in grado di utilizzare l’ossigeno, ma solo a concentrazioni ridotte (nell’ordine delle micromoli). La loro crescita è inibita dalle concentrazioni normali di ossigeno, quindi bisogna creare un’atmosfera che abbia il 15-10 % in meno di ossigeno, nello specifico questo si ottiene aggiungendo un 5 % di CO2. Esistono dei termostati alla CO2 in qui basta spingere un pulsante per attivare un richiamo di CO2 da una bombola, creando un ambiente al 5-10 % di CO2 nel vano del termostato, ed essendo la CO2 più pesante dell’ossigeno, lo elimina. Avremo così una percentuale in meno di ossigeno, che permette lo sviluppo dei batteri microaerofili.

  • Batteri molto aerobi

Devono respirare moltissimo, la concentrazione di ossigeno normale di solito è sufficiente, ma se li metto in un brodo che si muove, questo permette di ossigenare molto meglio tutto il volume del brodo ed i batteri avranno una maggiore capacità di moltiplicarsi.

LA TEMPERATURA D‘INCUBAZIONE

L’incubazione dipende dal tipo di batterio che vogliamo sviluppare, infatti ogni batterio si sviluppa ad una certa temperatura, ci sono dei batteri che richiedono anche delle temperature di 4° C, ad esempio quando si vuole far emergere una Listeria monocytogenes da un campione in cui è poco rappresentata, bisogna lasciare il campione per 7 giorni a 4° C, perché essendo un batterio psicrotrofo, la Listeria si moltiplica come fosse in un termostato, mentre gli altri microrganismi rimangono in batteriostasi e non crescono numericamente, così la Listeria avanza numericamente e la posso mettere in evidenza. Ci sono i termostati a 22° C che servono per la moltiplicazione dei batteri tipicamente ambientali , a 32° C per gli altri tipi ed a 37° C per i patogeni, mentre da 45° C in su si moltiplicano i termofili.

LA CLASSIFICAZIONE IN BASE ALLA TEMPERATURA DI SVILUPPO

Qui vediamo la capacità o meno di alcuni microrganismi di svilupparsi a determinate temperature e come vengono classificati in base a questa caratteristica: gli psicrofili, gli psicrotrofi, i mesofili, i termofili e gli ipertermofili, che sono quelli che possono svilupparsi anche a temperature attorno ai 100° C.

  • Gli psicrofili (Pesudomonas, Vibrio, Alcaligenes, Bacillus e Shewanella sono gli esempi più importanti) crescono anche a 0° C (come fa un batterio a crescere bene a 0°C se il suo citoplasma è costituito in gran parte da acqua? Non congela perché ha una concentrazione di sali molto elevata, che abbassa il punto di congelamento) ed hanno una temperatura ottimale minore o uguale a 15° C, con una temperatura massima di 20° C, vengono isolati di frequente dagli habitat artici ed antartici, dove l’acqua è in genere uguale o minore in termini di temperatura a 5° C.
  • I mesofili sono dei microrganismi con una temperatura ottimale compresa tra 20 e 45° C ed una temperatura minima di 15-20°C, questa categoria comprende la maggior parte dei microrganismi ed in particolare dei patogeni, considerando la temperatura degli ospiti in cui questi albergano
  • I termofili sono quei microrganismi in grado di crescere a 55° C o a temperature superiori, la temperatura minima è in genere intorno ai 45° C e spesso le temperature ottimali sono tra 55 e 65° C. I termofili sono quasi esclusivamente dei procarioti. Questi microrganismi crescono nei concimi organici o nelle cataste di fieno con un fenomeno di autoriscaldamento. Come fa un termofilo a svilupparsi a temperature maggiori del punto di ebollizione dell’acqua? È la stabilità della proteine termostabili, altamente organizzate ed idrofobiche, che sono tuttora studiate, a permettere questo fenomeno. Gli arcibatteri hanno queste caratteristiche.
  • Sono detti ipertermofili quei microrganismi in grado di crescere a 90°C o a temperature superiori, in certi casi superiori ai 100 gradi centigradi, fino a 113° C. In genere tali batteri non riescono a crescere quando le temperature scendono a valori inferiori di 55° C.

IL DIFFERENTE SVILUPPO IN UN TERRENO LIQUIDO E SOLIDO

Capita tutti i giorni di dover contare quanti sono i microrganismi presenti in un campione. Se prendiamo un campione polimicrobico e lo seminiamo in un TSB, il giorno dopo la provetta sarà completamente torbida, anche se c’era una, mille o un milione di specie diverse, la provetta dentro appare sempre uguale, al massimo possono formarsi delle pellicole ma non riesco a riconoscere una singola specie. Un batterio seminato oggi a quest’ora, in 18 ore raggiunge la sua massima concentrazione che viene definita nella curva di crescita del batterio fase stazionaria, che porta il batterio a raggiungere 109 unità formanti colonie / mL.

LA CURVA DI CRESCITA DI UN BATTERIO IN UN TERRRENO LIQUIDO
Se semino un batterio in un brodo colturale questo ha una certa latenza prima di iniziare a svilupparsi, cioè prima che inizi a dividersi passano alcune ore: c’è una fase di latenza iniziale detta fase di lag o fase di stasi che può durare anche 2-4 ore, il tempo necessario al batterio per adattarsi all’ambiente e trovare gli enzimi da utilizzare per aggredire il nuovo substrato. Il numero di cellule rimane invariato, al massimo le cellule aumentano di volume, perché ad un certo punto dovranno dividersi. Poi abbiamo una prima curva detta fase di accelerazione di crescita, fino ad arrivare al punto più importante della curva di crescita batterica che è la fase di crescita logaritmica (o fase log), durante la quale i batteri si replicano ogni 20 minuti in vitro, circa ogni ora in vivo perché sono ostacolati invece da fattori di diverso genere.I terreni liquidi sono utilizzati per fare delle colture pure di una sola specie microbica, di certo non per isolare un batterio da un’urinocoltura o da una coprocoltura, che sono dei campioni polimicrobici nei quali di solito i patogeni sono meno rappresentati dei commensali , ed è per questo che devo trovare la maniera per fare emergere il batterio che mi interessa usando i terreni selettivi. In ordinata ci sono il numero delle cellule batteriche (o altre volte il numero delle unità formanti colonie), in ascissa abbiamo invece il tempo.

Se il batterio continuasse a moltiplicarsi come nella fase log, dopo 45 ore avrebbe già generato una colonia di volume maggiore dell’intero pianeta Terra. Ovviamente questo non avviene e la fase di crescita esponenziale si ferma prima perché sopraggiungono i fattori limitanti: ogni coltura, ogni popolazione ha un limite al di sopra del quale non si può andare, che per i batteri è intorno a 5 * 109, massimo 1010, dopodiché inizia una decelerazione della crescita che porta alla fase stazionaria, ovvero la condizione in cui abbiamo raggiunto il massimo limite possibile di questa popolazione all’interno di questo ambiente. Il limite è dettato dalla mancanza di nutrimenti ed all’aumento dei cataboliti, mentre la fase di decelerazione inizia perché aumentano sempre di più i rifiuti tossici dei batteri dentro la coltura. Secondo alcuni autori durante la fase stazionaria i batteri continuano a crescere molto lentamente ma tanti ne muoiono, quanti se ne formano in ogni istante, quindi il loro numero complessivo non cambia, secondo altri invece i batteri attuano un quorum-sensing, come un progetto per ridurre le nascite, ovvero limitano la loro moltiplicazione e rimangono più o meno costanti consumando meno terreno possibile. Posso mantenere una popolazione in fase di crescita stazionaria anche per mille anni, ma naturalmente devo continuamente eliminare parte dei cataboliti ed aggiungere parte dei metaboliti. Questo si fa con degli strumenti come il chemostato, che ci permette di ottenere delle colture continue.

Nel chemostato viene immesso del nuovo terreno sterile nel recipiente di coltura alla stessa velocità a cui viene rimosso il terreno contenente i microrganismi. Di solito il terreno contiene un componente (ad esempio un aminoacido) in quantità tali da renderlo un fattore limitante della crescita e la densità cellulare finale dipende dalla concentrazione del nutriente limitante.

Abbiamo del terreno fresco, nuovo, continuamente pompato a goccia a goccia nel recipiente di coltura, mentre dall’altra parte fuoriesce del terreno che è già stato utilizzato con i batteri morti ed i residui tossici dovuti ai cataboliti dei microrganismi.

In questo modo si mantengono le colture in fase stazionaria finché si vuole, permettendo il loro utilizzo in campo industriale per la produzione di alcune sostanze come gli antibiotici. I fermentatori industriali ci permettono di mantenere inalterate per sempre le caratteristiche dei batteri che vengono addizionati come starter per alcuni alimenti, oppure i lieviti addizionati allo champagne, o i lattobacilli che vengono addizionati agli yogurt. Con questo sistema dispongo di una massa batterica fissa in una coltura pura, dalla quale attingere in ogni momento per ricavarne quello che mi serve.

Ad un certo punto però, se non mantengo la colonia in colture continue, la curva di crescita cala e inizia la fase di declino o di morte. Se lascio semplicemente la mia coltura ad incubare ad una certa temperatura, alla fine muore perché vengono a mancare tutti i metaboliti ed i cataboliti vanno a sovrastare tutto il resto e soffocano i microrganismi.

LA FASE LAG

Quando i batteri vengono inoculati in un nuovo terreno non si osserva un aumento immediato del numero di cellule, per questa ragione tale periodo è definito fase di latenza (o fase lag). In questo periodo la cellula è impegnata attivamente nella sintesi di nuovi componenti necessaria per diversi motivi:

  • Le cellule possono essere vecchie e prive di ATP, di cofattori, di ribosomi, i componenti che devono essere sintetizzati prima che la crescita possa cominciare
  • Il terreno può essere diverso da quello in cui il batterio cresceva prima e quindi dovrà produrre degli enzimi diversi per utilizzare i nuovi nutrienti
  • I batteri possono essere danneggiati e quindi devono avere il tempo per il loro riparo

Il numero di cellule della coltura in fase lag rimane pressoché costante, mentre può aumentare la dimensione delle cellule. La durata della lag fase dipende da molti fattori come la composizione del substrato di crescita, la temperatura (diventa più lunga se è stata conservata al freddo), l’atmosfera di incubazione, la quantità dell’inoculo e lo stato fisiologico delle cellule al momento dell’inoculo (è lunga se l’inoculo proviene da una coltura vecchia).

LA FASE ESPONENZIALE LOG (o LOGARITMICA)

I microrganismi si moltiplicano alla massima velocità relativamente al loro potenziale genico, alla natura del terreno ed alle condizioni in cui avviene la crescita. I microrganismi si dividono e raddoppiano ad intervalli di tempo regolari. La crescita è bilanciata, cioè tutte le componenti vengono sintetizzate ad un tasso costante le une rispetto alle altre. Se cambiano i livelli dei nutrienti la crescita diventa non bilanciata fino a che non si raggiunge un nuovo equilibrio.

LA FASE STAZIONARIA

La crescita infine cessa e l’andamento della curva diventa orizzontale, questo in genere avviene quando la popolazione batterica raggiunge la densità di circa 109 cellule per ml. Alcuni microrganismi non raggiungono mai queste concentrazioni, come ad esempio le colture di alghe e di protozoi, che arrivano a 106. La fase stazionaria viene raggiunta anche in natura spesso in relazione alla mancanza di nutrienti. Questa condizione può anche essere un’esperienza positiva per i batteri che ad esempio possono rispondere con una diminuzione delle proprie dimensioni, con la contrazione del protoplasto. Ma i cambiamenti più importanti sono a livello della fisiologia perché possono produrre delle apposite proteine di deprivazione nutrizionale, che rendono la cellula più resistente ai possibili danni.

FASE DI DECLINO O DI MORTE

I cambiamenti ambientali nocivi come l’esaurimento dei nutrienti o l’accumulo di metaboliti tossici portano alla diminuzione del numero di cellule vitali, una caratteristica della fase di morte. Anche questa fase può avere un andamento logaritmico, cioè possiamo avere la morte di una certa percentuale di cellule ogni ora. Spesso la torbidità resta uguale perchè le cellule non vengono lisate, quindi per stabilire il numero delle cellule vive si devono eseguire delle subcolture.