Esotossine batteriche

Le esotossine possono essere suddivise in base al tropismo, alla struttura ed in base al meccanismo d’azione. Le esotossine sono i veleni biologici più potenti che abbiamo.

– SUDDIVISIONE IN BASE AL TROPISMO

  • pantrope, cioè aggrediscono qualsiasi tipo di cellula, qualsiasi tipo di tessuto
  • altre invece sono più specifiche: le neurotossine, le emolisine (attaccano i globuli rossi) e le enterotossine

– STRUTTURA MOLECOLARE

  • esotossine monomeriche (una grossa molecola di parecchie decine di dalton)
  • esotossine dimeriche di tipo AB (A = activity, B = binding)
  • esotossine multimeriche di tipo AB
  • esotossine multifattoriali, nel caso in cui si tratti di molte proteine

– MECCANISMO D’AZIONE

Diversi tipi di tossine agiscono in modi diversi: con un’azione citolitica, un danno al citoscheletro, un danno alla membrana, ed altri meccanismi ancora. Esistono delle tossine che agiscono sulla superficie, delle tossine che formano dei pori, delle tossine di tipo AB e poi delle tossine con particolari sistemi di secrezione:

  1. Surface acting toxins
  2. Pore Forming
  3. Tipo AB
  4. Tipo III e IV
  1. Surface acting toxins: sono delle tossine che agiscono sulla superficie, non entrano nella cellula però fanno parecchio danno perchè sono in genere dei superantigeni. L’antigene normale viene presentato nella tasca tra due recettori, il superantigene invece è una molecola che lega le molecole MHC ed il recettore TCR, attivando le cellule T. La conseguenza è che un antigene normale attiverà la cellula 10 volte, un superantigene la attiverà 10 – 100 volte tanto, in modo aspecifico e non controllato. Provocano un massivo rilascio di citochine, cruciali nelle conseguenze chimiche:

– Shock tossico

– Vomito e diarrea

– Esantemi

Le più comuni sono le enterotossine stafilococciche e streptococciche. Queste tossine creano un danno perchè costringono l’ospite ad un’azione smodata, e questo ha un grossissimo impatto.

  1. Pore forming: sono delle tossine che formano dei pori. Sono delle tossine che uccidono. Possono essere delle porine oppure possono avere un’attività enzimatica fosfolipasica.
  • porine: sono delle proteine che entrano fisicamente nella membrana della cellula, si forma quindi un poro in questa membrana. Spesso sono inattivate dall’ossigeno e causano la morte della cellula. Tra queste tossine troviamo molte emolisine e la distruzione del globulo rosso è importante, perchè attraverso la ricerca in laboratorio di emolisine si può fare il riconoscimento di una specie batterica. Esistono dei batteri che producono delle porine e se queste porine aggrediscono il globulo rosso prenderanno il nome di emolisine. Di queste emolisine ne esistono di diverso potenziale e quindi l’effetto che viene provocato in laboratorio cambia, consentendo di distinguere attraverso una visualizzazione macroscopica diversi tipi di batteri. Se noi coltiviamo certi batteri su un terreno particolare che si chiama Agar Sangue (sono dei terreni rossi perchè ci sono le emazie) e se noi su questo terreno coltiviamo dei batteri che producono delle emolisine, succede che man mano che il batterio cresce, intorno a questa colonia si formano degli aloni di diverso tipo. A seconda di come appare questo alone noi possiamo dire se il batterio è a-emolitico, b-emolitico o g-

a-emolitico: abbiamo un’emolisi parziale, con un colore verdastro

b-emolitico: massima emolisi, il terreno perde completamente il suo colore rosso, diventa trasparente, perchè intorno a ciascuna di queste colonie è stata rilasciata l’emolisina e questa ha degradato completamente i globuli rossi

g-emolitico: le tossine non creano nessuna lisi, il terreno rimane rosso

  • molecole ad attività enzimatica fosfolipasica: attuano un taglio nella membrana della cellula bersaglio, quando la tossina viene rilasciata dal batterio. Nella cellula bersaglio andrò a tagliare fisicamente attraverso un’attività enzimatica fosfolipasica i ponti tra i gruppi fosfato, la membrana si sfalderà nel giro di poco tempo. Ci sono anche altre classi di molecole che utilizzano lo stesso meccanismo d’azione:

– FOSFOLIPASI: ad esempio la tossina a del Clostridium perfingens

– ELASTASI: agisce sull’elastina ed è quindi associata alle patologie polmonari

– TOSSINA ESFOLIATIVA: l’effetto macroscopico è proprio l’esfoliazione della cute perchè questa molecola degrada l’epidermide, le strutture tra le cellule, le membrane. Si chiama anche “sindrome della cute ustionata”. Il batterio produce una tossina che va ad interferire con l’assetto delle cellule dell’epidermide.

  1. Tipo AB: sono così chiamate perchè sono fatte da almeno due elementi che hanno delle funzioni differenti. La porzione B (o Binding) è responsabile del tropismo, la porzione A (o Activity) è quella che media l’attività tossica. Questa porzione A potrà avere attività diverse.

Di questa classe fanno parte le tossine del tetano, della difterite, del colera e della pertosse. Le tossine di tipo AB possono essere semplici o complesse:

– Semplice: con una porzione A ed una porzione B

– Complessa: è un polimero, con una porzione A e tante porzioni B tutte uguali. Non si conosce il motivo di questa ridondanza.

Come entrano queste tossine? Ci sono due modi:

ENDOCITOSI DI TUTTA LA TOSSINA: quando la tossina riconosce il suo recettore, si forma il dimero, poi abbiamo l’internalizzazione e la formazione di un vacuolo di pinocitosi. Da questo vacuolo ci sarà poi un’acidificazione che consente alla porzione A di sganciarsi da quella B che si degraderà. La porzione A viene liberata nel citoplasma, dove potrà agire. In questo caso abbiamo quindi un’internalizzazione di tutto il blocco AB.

INOCULAZIONE DELLA PORZIONE A: dopo il legame specifico si internalizza solo la porzione A, gli eventi successivi saranno analoghi.

Vediamo qualche esempio:

DIFTERITE: è una malattia molto grave (noi siamo tutti vaccinati), provocata da diversi fattori di virulenza, la cui tossina è pantropa, cioè colpisce tutte le cellule, le prime che vengono colpite sono quelle dell’epitelio respiratorio. Ha attività ADP-ribosilante verso l’Elongation Factor 2 (o EF2): la conseguenza molecolare è il blocco della sintesi proteica, portando quindi ad una morte cellulare.

COLERA: ha una struttura complessa, abbiamo due porzioni A e cinque porzioni B, l’epitelio bersaglio è l’epitelio intestinale. Una volta che la tossina è penetrata nella cellula, il ponte disolfuro della subunità A viene scisso, liberando, così, le due frazioni A1 ed A2. Ciò ha come risultato un continuo stato di attivazione della proteina G che va a stimolare l’attività di un adenilato ciclasi. L’elevata presenza di cAMP risultante, ha sui villi l’effetto di bloccare l’ingresso di sodio, cloro ed acqua mentre a livello delle cripte aumenta la diffusione verso il lume di sodio, cloro, ed acqua (ho una diarrea). Quindi il nostro intestino non solo non assorbe, ma perde acqua.

CARBONCHIO: un altro esempio di molecola di tipo AB, multifattoriale, è la tossina del carbonchio. La malattia dell’antrace era finita sui giornali nei 2001 per il bioterrorismo, venivano inviate delle buste contenenti delle spore di carbonchio.

La tossina del carbonchio è multifattoriale perchè è composta da tre macromolecole, tre proteine che lavorano in sintonia, ognuna delle quali con delle caratteristiche diverse:

PA, antigene protettivo di più di 80 kD, protettivo perchè gli anticorpi contro questo antigene sono protettivi

LF, fattore vitale (o life factor), che può uccidere se ne inoculiamo dosi massicce

EF, fattore edematoso, che sperimentalmente provoca un edema

L’antigene protettivo PA è il primo che deve entrare in gioco perchè funge da molecola antirecettoriale, capace di riconoscere il bersaglio sulla cellula ospite: questo lo fa in una maniera un po’ particolare. Questo PA è di circa 80 kD e deve riconoscere il recettore sulla superficie, ad esempio, dell’epitelio polmonare: appena si lega, questa macromolecola viene ridotta di circa 20 kD, c’è un taglio (o clivage), legato ad una proteasi cellulare. La cellula stessa, con un’endonucleasi che ha anche un ruolo più fisiologico di questo, è in grado di tagliare da 80 a 60 kD questo PA e solo a questo punto questo può fungere da recettore per LF e EF, e legarli esponendo un sito di legame.

A questo punto sulla superficie della cellula si inseriranno subito dopo il fattore LF ed il fattore EF legandosi a PA, che fa da navetta, da carrier. I veri fattori tossici sono LF ed EF, PA è solo il sistema di internalizzazione.

EF, il fattore edematoso, ha un’attività adenilato ciclasica (tutte le intossicazioni da tossina AB sono ad attività ribosilante, o adenilato ciclasica, o proteolitica): c’è quindi un’overproduzione di cAMP. Gli effetti sono molteplici, perchè è diverso se siamo nel polmone o nell’intestino, ma c’è un’alterazione della funzionalità della cellula. LF ha un’attività proteasica che degrada delle chinasi cellulari, vengono alterate le gestioni intracellulari dei messaggeri, quello che ne deriva è una grossa produzione di citochine, quindi si ha un danno, un edema, un richiamo di cellule immunitarie e la morte delle cellule stesse.

La storia è fatta di fasi in cui ogni macromolecola ha il suo ruolo. Quello che sappiamo dai casi clinici e sperimentali è che tra loro queste molecole interagiscono e sinergizzano.

NEUROTOSSINE: le tossine del tetano e del botulino sono del tipo AB semplice, composte da un elemento di legame e da un elemento tossico. Sono tutte e due ad attività proteolitica, però agiscono a livelli diversi, il dato clinico quindi sarà diverso. In entrambi i casi queste due molecole bloccano attraverso un’azione proteolitica le funzioni secretorie dei neuroni: si chiamano infatti neurotossine perchè agiscono sui neuroni, che vengono inibiti nel rilascio dei neurotrasmettitori.

Nel Clostridium tetani, la tossina del tetano che si chiama tetanospasmina o tetanotossina, arriva nel corno anteriore del midollo spinale a livello delle giunzioni interneuronali e impedisce al neurone inibitore di rilasciare le vescicole di neurotrasmettitore (GABA). In quel caso clinico ogni stimolo eccitatorio che arriva dalla periferia non sarà compensato da quello inibitorio: la conseguenza sarà un sorriso tonico, cioè i muscoli si contraggono e non si rilasciano più. Dopodichè si aggiungono altri muscoli che ci portano alla morte: i muscoli respiratori si contraggono ma non si rilasciano e avviene la morte per soffocamento.

Nel Clostridium botulinum, nella patologia da botulismo, si ha sempre una proteolisi però a livello della placca neuromuscolare, in periferia. Il motoneurone che innerva un muscolo è intaccato dalla tossina del botulino e viene inibito nella sua capacità di rilasciare ACH. Si ha una paralisi muscolare flaccida. A fine degli anni 90 si è scoperto che la secrezione di GABA o di ACH passa attraverso un’esocitosi di microvacuoli contenenti questi trasmettitori. Perchè questa secrezione sia possibile è necessario che ci sia un contatto tra alcune proteine sulla superficie dei vacuoli dei neurotrasmettitori e altre proteine sulla superficie del neurone. Le vescicole che contengono il neurotrasmettitore hanno sulla loro membrana delle proteine che si chiamano sinaptobrevine, di 120 kD, che devono interagire perchè ci sia l’esocitosi, con un’altra molecola che è sulla faccia interna della membrana della terminazione nervosa, che si chiama sintassina. Queste due molecole si legano tra di loro in modo che la vescicola possa fondersi con la membrana del terminale dell’assone. La sinaptobrevina e la sintassina devono entrare in contatto ed il riconoscimento tra queste due molecole consente l’esocitosi del neurotrasmettitore. Se c’è la tetanospasmina o la tossina del botulino c’è un taglio proteolitico della sintassina o della sinaptobrevina, quindi non è più possibile l’esocitosi. Che sia dopo un motoneurone periferico o che sia tra le giunzioni interneuronali l’effetto è sempre lo stesso: si ferma la secrezione di neurotramettitore.

  1. Tipo III e IV: viene cambiato spesso nome a questo gruppo. Esistono delle tossine batteriche, alcune del tipo AB, altre completamente diverse, quasi sempre ad attività enzimatica, che vengono secrete nella cellula bersaglio. Il batterio, attraverso un sistema tipo siringa, un macrocomplesso molecolare, inocula la tossina all’interno della cellula bersaglio. Questo è un metodo particolarmente aggressivo per inoculare la tossina. Esistono diversi tipi di sistemi secretori per cui la tossina può essere sparata in diverse maniere: ci può essere una grossa macromolecola che prende tutta la membrana sia interna che esterna, oppure ci sono due sistemi diversi, o dei sistemi a cascata. La letteratura ci descrive tanti modi diversi per questo atto di trasferimento della tossina dal batterio alla cellula bersaglio. Quello che ci interessa dal punto di vista biologico e clinico è che la tossina non va in circolo, non si disperde.

La Yersinia pestis, il primo descritto e più famoso in assoluto, ha tra i suoi fattori di virulenza anche una serie di molecole che formano un canale che fisicamente trasferisce la proteina esterna della Yersinia (Yops) dalla cellula batterica alla cellula bersaglio. Questa molecola, oltre ad avere un’attività protein-cinasica, può avere un’attività litica e può attaccare il citoscheletro della cellula, impedendo la trascrizione cellulare. E’ un gruppo di tossine un po’ particolari per questa loro caratteristica di essere direttamente trasferite dal batterio alla cellula bersaglio. Il batterio si è fatto particolarmente cattivo ed ha messo a punto una serie di geni per costruirsi questo canale di connessione e trasferire la tossina facilmente. C’è un elemento di virulenza in più che complica ulteriormente l’interazione con l’ospite.