Crescita batterica

LA COSTRUZIONE DELLA CURVA DI CRESCITA

La costruzione della curva di crescita batterica si esegue osservando la graduale torbidità della provetta (usando lo spettrometro) oppure con una subcultura in un terreno solido a partire da una brodocoltura pura.

IL BIOFOTOMETRO

Il biofotometro non è altro che un termostato che si può regolare ad una data temperatura e che presenta un supporto girevole dove vanno posizionate le provette, che ruotando ogni tanto passano davanti ad una fonte luminosa, ed ogni volta la provetta viene irradiata dalla luce, mentre dalla parte opposta si valuta quanta luce passa e quanta ne viene trattenuta (assorbanza / trasmittanza). Se io prendo una provetta nella quale ho seminato un solo batterio, questa sarà limpida, perché un batterio non dà alcuna torbidità ed il 100 % della luce viene trasmessa con un assorbimento nullo. Gradualmente la provetta diventa sempre più torbida ed assorbe molta più luce (o meglio la devia), di conseguenza se ho un registratore dalla parte opposta che mi segna con un puntino in relazione all’aumentata torbidità, alla fine della giornata ottengo un lungo foglio sul quale è stata registrata tutta la curva di crescita come l’andamento dell’aumento della torbidità della coltura in un terreno liquido. Oltretutto questo sistema ci permette di ottenere contemporaneamente le curve di crescita misurate su più campioni contenenti o batteri diversi, o lo stesso batterio trattato diversamente (aggiungendo un antibiotico, una vitamina od un aminoacido), in modo da andare a vedere come si esprime il batterio nella fase di crescita a seconda delle condizioni da me modificate nel terreno di coltura. Il biofotometro fornisce già lo schema con le diverse curve di crescita misurate su ciascun campione, segnate con colori diversi. Una colonia inizia a diventare torbida quando i batteri raggiungono 104-105 unità formanti colonie / ml, ed è da questa concentrazione in poi che il registratore inizia a segnare sul tracciato i punti della curva di crescita.

LO SPETTROFOTOMETRO

Ha la stessa funzione del biofotometro ma la differenza sta nel fatto che il biofotometro è anche all’interno di una struttura riscaldata e posso avere anche un termostato, contemporaneamente alla valutazione della torbidità, mentre faccio crescere il batterio. Nello spettrofotometro invece ogni ora devo andare a ricavare dalla provetta una piccola quantità del suo contenuto, metterla nella cuvetta (un contenitore che ospita il campione da analizzare), infilare la cuvetta nello strumento, vedere il valore dell’assorbimento e segnare a penna il grafico punto per punto con i valori che ottengo via via con questo procedimento. Può capitare di dover partire da una certa concentrazione di batteri che voglio ottenere senza stare a fare ogni ora la subcultura, per sapere quale concentrazione ho in quel momento, fino a quando avrò raggiunto la concentrazione che mi serve. Se conosco già la curva di crescita di un particolare ceppo microbico, so che ad un certo assorbimento di luce che ottengo nello spettrofotometro corrisponde una certa concentrazione di batteri. Se devo ottenere una brodo coltura di 106 unità formanti colonia, che mi serve per un esperimento, semplicemente faccio crescere il batterio, lo metto nello spettrofotometro e dico “so che questo batterio raggiunge la concentrazione di 106 quando ha un assorbimento di luce di un tot “, allora quando registrerò quel valore di assorbimento saprò che ho la mia brodocoltura alla concentrazione che volevo. Quindi è importante avere la curva di crescita di un batterio che sto studiando per sapere dopo quanto tempo ottengo un certo valore di assorbimento ed a che concentrazione corrisponde. Lo spettrofotometro ed il biofotometro mi danno una valutazione sulla torbidità, che però deve essere confermata e rapportata alle unità formanti colonie, sulla base della quantità dei batteri.

IL CONTEGGIO DEI BATTERI MEDIANTE UNA SUBCOLTURA

È il metodo di conta dei batteri più usato ed attendibile. Faccio delle semine ora per ora o mezz’ora per mezz’ora, in un terreno solido. Semino in una piastra 1 ml, poi la metto ad incubare e andrò a vedere il risultato il giorno dopo. Semino alla seconda ora su un’altra piastra un altro ml, e così via ogni ora. Se lo faccio per 24 ore, il giorno dopo avrò 24 piastre e vado a contare quante colonie ho per piastra.

Se sono in una fase stazionaria, prelevo 1 ml e lo vado a seminare, questo mi cresce fino a 109, ma in una piastra al massimo si contano 103 batteri, quindi dovrò operare una serie di diluizioni perché altrimenti non capisco niente. Arrivati più o meno al punto in cui siamo a 103, tutte le piastre di semina successive sono talmente concentrate di microrganismi che invece di crescere delle colonie separate da poter conteggiarle e segnarle con il pennarello, cresce una patina confluente che non fa capire quanti sono i batteri, allora bisogna ricorrere ancora alle diluizioni, fino a che ottengo delle colonie separate che posso contare, poi moltiplicando per le diluizioni effettuate risalgo al numero di batteri presenti in origine su ciascuna piastra.

Se contemporaneamente ad ogni ora rilevo dallo spettrofotometro il valore dell’assorbimento, alla fine saprò che in un dato istante ho una certa concentrazione, quindi un certo assorbimento di luce, ed un certo numero di batteri, perché li ho contati sulla piastra corrispondente attraverso delle diluizioni successive. Il giorno dopo avrò quindi che ad una certa concentrazione e ad una certa torbidità corrisponde una certa quantità di microrganismi. Avere già la curva di crescita di un batterio che mi conferma che ad una certa torbidità corrisponde una certa concentrazione batterica mi dà un enorme vantaggio.

  • IL CONTEGGIO CON LE CAMERE DI BURKER-THOMA

Il metodo più semplice ed economico è il conteggio diretto con l’uso di una camera di conta, nello specifico il conteggio risulta più facile se i batteri sono stati colorati. La popolazione deve essere però grande, perché la diluizione che si impiega può condizionare il risultato, inoltre risulta impossibile distinguere i batteri vivi dai morti. Ci sono anche degli apparecchi elettronici come i contaglobuli che si basano sull’aumento della resistenza elettrica. Per la conta dei globuli rossi, dei globuli bianchi e delle piastrine, dei lieviti e dei batteri si utilizzano le camere di Burker e Thoma. Queste camere di conta sono come dei vetrini scanalati con una griglia in mezzo, ci si mette sopra un coprioggetti, che è molto robusto, e va umidificato e stretto molto forte al vetrino per fare in modo che si attacchi per capillarità e non si sposti più. È come se il coprioggetti fosse appiccicato al vetrino sottostante, però lascia un’intercapedine all’interno della quale con la pipetta si può infilare una certa soluzione contenente dei batteri o dei globuli rossi, che naturalmente và diluita. Poi si guarda al microscopio ottico. Si contano quanti quadretti ci sono, quanti globuli rossi o batteri ci sono per quadretto, si moltiplicano per i quadretti, si moltiplica per la diluizione e si risale al numero totale. Ovviamente le camere di Burker-Thoma saranno diverse nella quadrettatura della griglia a seconda delle particelle che devo andare a contare.

LA FILTRAZIONE

É un meccanismo molto usato. Nelle analisi delle acque usate per produrre i farmaci la carica microbica deve essere inferiore a 1 / mL. Essendo la carica molto bassa non posso andare a seminare 1 ml in una piastra, come nella semina previa diluizione, perché non crescerebbe nulla. Allora filtro 100 mL di acqua facendola passare per mezzo di un imbuto sterilmente attraverso una membrana di poliacrilamide quadrettata. La membrana ha dei pori di dimensioni inferiori di quelle del batterio: tutta l’acqua passa ed i batteri rimangono in superficie. Poi prendo questo filtro e lo vado a posizionare su una piastra in cui ho disposto il mio terreno agarizzato (se devo cercare dei batteri di un certo tipo metto invece un terreno selettivo). La membrana deve aderire perfettamente alla superficie del terreno in modo tale che i materiali nutrizionali passino attraverso il filtro e vadano ad arricchire i batteri che stanno sulla superficie, questi pescano dalla membrana stessa e costruiranno le colonie sulla membrana. Questo metodo viene allestito di solito per valutare la quantità di microrganismi rappresentati in un volume molto ampio o perché sono pochi, mentre se i batteri sono tanti devo seminarli in un volume molto più basso perché altrimenti non riesco neanche a contare le colonie che si uniscono in una patina confluente.

LE MODALITÁ DI SEMINA

  • SEMINA QUANTITATIVA

Quando si devono conteggiare i batteri presenti in un campione facciamo un’analisi quantitativa, in particolare bisogna seminarli sempre in un volume preciso. Nell’urinocoltura dobbiamo sapere quanti sono i batteri rappresentati in un certo volume di urina, perché solo quando abbiamo più di 20 * 103 unità formanti colonia / mL possiamo parlare di cistite, quando siamo a dei valori inferiori no. Oltretutto il batterio deve essere di un solo tipo, quindi se abbiamo una contaminazione con più batteri vuol dire che il materiale è stato raccolto male, senza la tecnica del mitto intermedio, che permette di raccogliere solo l’urina presente nella vescica, senza la prima urina che esce, che raccoglie molti saprofiti presenti nello humor uretrale che non centrano niente con la cistite.

Ho il mio contenitore di urina, semino 100µL in una provetta di fisiologica da 9,9 mL, effettuando una diluizione di 10-2, poi da questa provetta prelevo 100 µL che vado a seminare su una piastra di agar sangue e su una piastra di MacConkey. Se il giorno dopo sono cresciute 3 colonie, per sapere quanti batteri / mL avevo nel campione originario di urine devo moltiplicare per 1000, perché ho fatto prima una diluizione di 10-2 mettendo 100 µL (o 0,1 mL) in una provetta con 9,9 mL di soluzione fisiologica (ho diviso il volume iniziale 1:100), poi ho preso la decima parte di 1 mL, che sono 100 µL, e li ho messi in una piastra, ma siccome il risultato si dà come “numero di batteri per mL” devo calcolare anche questa come una diluizione, perché ho preso solo 1/10 del mL, infatti se semino 0,1 mL ho fatto una diluizione di 10-1 che moltiplicata per la diluizione precedente di 10-2 mi dà 10-3. Se ho fatto una diluizione per tornare al valore reale iniziale devo moltiplicare 3 per 1000, che fa 3 * 103, ovvero non c’è una cistite (siamo al di sotto di 20 * 103).

Quindi per un’analisi quantitativa devo seminare dei campioni sempre abbastanza moderati come volume, al massimo posso andare a seminare 1 mL, comunque di solito si preferisce rimanere sotto gli 0,5 mL. Oltretutto deve essere una semina a tutta piastra, cioè metto una goccia ad esempio di 0,1 mL al centro della piastra e poi con una spatolina striscio il materiale su tutta la piastra in un verso e nell’altro in maniera da renderlo uniforme su tutta la superficie, questo permette ai batteri di disporsi sulla superficie e lì dove si trova un batterio esso forma una colonia. Se il giorno dopo crescono 30 colonie, allora siamo a 30.000 batteri, che è già superiore a 20 * 103, quindi siamo in presenza di una cistite.

Quando eseguo un’analisi quantitativa posso anche seminare in inclusione nell’agar-germi, con il vantaggio di impedire alle colonie, che sono imprigionate nell’agar, di svilupparsi troppo in volume, rimanendo limitate nello spazio in modo da poter contare più facilmente le colonie che non tendono a formare una patina confluente. Di solito la semina in inclusione, essendo più precisa dà, un conteggio superiore. Rimane preferibile la semina in superficie per alcuni batteri che sono avidi di ossigeno. Nel caso dell’urina si semina in superficie perché dobbiamo vedere se le colonie sono in numero maggiore di 30.

  • SEMINA QUALITATIVA

Serve a fare emergere un ceppo microbico specifico da un campione con la flora microbica mista, come ad esempio nelle coprocolture. Nelle feci ci sono molti commensali ed eventualmente possono esserci dei patogeni che danno la gastroenterite. In questo caso non mi interessa sapere il numero ma solo la presenza o l’assenza di un certo microrganismo.

CATALASI SÍ O CATALASI NO?

La reazione della catalasi è utile per la determinazione della capacità di un batterio di scindere il perossido di idrogeno: per vedere se un batterio ha questo enzima basta mettere una goccia di perossido di idrogeno su una colonia del microrganismo e se sprigiona un’effervescenza vuol dire che ha distrutto con la sua catalasi il perossido di idrogeno. La catalasi è un enzima molto importante perché permette molto spesso al batterio di resistere all’attacco intrafagocitario.