Imprinting genomico e sindromi

L’imprinting genomico è l’espressione differenziale del materiale genetico a seconda che esso sia stato ereditato dal padre o dalla madre. L’imprinting genomico è tessuto-specifico e tempo di sviluppo-specifico, cioè l’espressione degli alleli può essere biparentale in alcuni tessuti ed uniparentale in altri.
Pertanto, in caso di patologia, si determina una diversa sindrome a seconda che il cromosoma alterato sia ereditato dal padre o dalla madre. Migliaia di geni presentano questo tipo di effetto, e sembrano essere quei geni correlati con la crescita e con il comportamento nello sviluppo precoce; tuttavia, alcuni di questi geni sono anche coinvolti in tumori e carcinomi. 

In particolare, l’imprinting genomico si estrinseca come forma di controllo dell’attivazione del genoma diretta da particolari geni che si ereditano in parte dalla madre e in parte dal padre. In pratica, alcune porzioni di genoma ereditate dalla madre e dal padre decidono in maniera esclusiva quali geni debbano essere attivi nel figlio, mantenendo inattivi gli altri mediante una specie di “guaina di rivestimento” che limita l’accesso al DNA per la sua lettura; il processo attraverso cui questo avviene è molto complesso e in parte ignoto. Quel che si sa è che le proteine prodotte da questi geni individuano la porzione da inattivare e ne richiamano altre che occludono l’accesso alla porzione di DNA mediante la modificazione chimica di alcune basi; in particolare se ne osserva la metilazione (l’aggiunta di gruppi chimici metilici –CH3). Questo tipo di modifica rende possibile la costruzione di un’impalcatura proteica che nasconde ulteriormente questa porzione all’accesso degli apparati di lettura del DNA. L’intero processo viene definito silenziamento del DNA. Per ogni embrione che si forma, l’imprinting viene azzerato e ristabilito caso per caso; pertanto è un processo reversibile e non ereditabile attraverso le generazioni. Quindi ad esempio un maschio, durante la gametogenesi, reimprinta in modo da avere espressione come nel padre anche sul gene con imprinting materno. Quindi, le caratteristiche dell’imprinting sono che:

  • Avviene prima della fecondazione
  • Deve conferire un silenziamento trascrizionale
  • Viene stabilmente trasmesso durante la mitosi alle cellule figlie
  • Deve essere reversibile (nella successiva gametogenesi)

 

Sindrome di PRADER-WILLI e Sindrome di ANGELMAN

Queste patologie sono dovute nella maggioranza dei casi (70 %) ad una DELEZIONE in regione 15q11-q13: si avrà una patologia diversa a seconda che venga deleto l’allele paterno (sindrome di Prader-Willi) o quello materno (sindrome di Angelman). Come in tutte le regioni soggette ad imprinting, quella sul cromosoma 15 ha una struttura bipartita: basta la perdita di una regione su uno dei due alleli per avere una delle due sindromi. Queste regioni sono dette AS-SRO e PWS-SRO (dove SRO sta per Short Region of Overlapping): basta che sia persa una di queste due piccole regioni per avere rispettivamente le due sindromi. Non è importante quanto sia ampia la delezione, non c’è correlazione, l’unica importante correlazione è con l’allele che viene deleto:

  • sull’allele materno la regione AS-SRO inattiva PWS-SRO, se viene perso l’allele materno si ha la sindrome di Angelman
  • viceversa, sull’allele paterno la regione PWS-SRO inattiva AS-SRO, se viene perso l’allele paterno si ha la sindrome di Prader-Willi

Un’altra possibile causa di queste sindromi è la DISOMIA UNIPARENTALE. Questo è un particolare meccanismo che viene attivato come salvataggio dalla trisomia 15, incompatibile con la vita: viene eliminato uno dei cromosomi 15 presente in sovrannumero, ma questo avviene in maniera apparentemente casuale, pertanto se si perde il cromosoma non disomico avremo un individuo che presenta due cromosomi di uno stesso genitore. Il meccanismo alla base di ciò è detto SALVATAGGIO DELLA TRISOMIA: se ho un concepimento trisomico (trisomia 15) ed ho la perdita dell’allele dell’altro genitore, avrò i cromosomi disomici di uno dei due genitori. Questo potrà essere per

  • Problema di non disgiunzione nella 1° divisione meiotica -> avrò i due cromosomi parentali -> parlo di “eterodisomia uniparentale”;
  • Problema di non disgiunzione nella 2° divisione meiotica -> avrò due cromatidi omologhi -> parlo di “isodisomia/omodisomia uniparentale”

Ad esempio, ipotizziamo che si abbiano due cromosomi 15 materni e uno paterno: il meccanismo di salvataggio ne elimina uno, ma se elimina quello paterno si avranno due cromosomi 15 entrambi provenienti dalla madre, quindi avremo un Prader-Willi. La disomia uniparentale del cromosoma 15 è responsabile del 20-25 % delle sindromi di Prader Willi (disomia uniparentale materna) e del 2-3 % delle sindromi di Angelman (disomia uniparentale paterna). La disomia uniparentale viene studiata in ogni caso in cui vi sia un riarrangiamento strutturale del cromosoma: ad esempio si fa nelle traslocazioni robertsoniane, che frequentemente coinvolgono il cromosoma 15 o il 14 (si fa anche quando di ipotizza un problema sul cromosoma 14). In sostanza, la perdita dell’allele materno o la presenza di un doppio allele paterno danno lo stesso risultato (sindrome di Angelman), e viceversa per la sindrome di Prader Willi. Ci sono dei casi dove se uno ha una mutazione eterozigote slatentizza lo stato di omozigote e diventa malato, ad esempio ci sono stati casi di fibrosi cistica che si sono manifestati in soggetti che hanno slatentizzato un’eterodisomia per la fibrosi cistica.

Per riassumere, la disomia uniparentale più frequente è la materna: ciò è dovuto alla non disgiunzione meiotica che è più frequente nella madre (ed è anche età dipendente).

ETERODISOMIA: c’è una non-disgiunzione nella prima divisione meiotica. Sarà normale la seconda divisione meiotica, in cui ci saranno tre cromosomi 15. Successivamente si avrà la perdita di uno dei tre cromosomi, ma quello dell’altro genitore.

ISODISOMIA: sarà normale la prima divisione meiotica, ma anormale la seconda in cui si presenterà una non-disgiunzione: si avranno due cromosomi 15 uguali fecondati con un gamete normale paterno. Successivamente si avrà la perdita del cromosoma 15 paterno. Si avranno quindi due cromosomi 15 in isodisomia uniparentale (nell’esempio isodisomia uniparentale materna).

Oltre alla delezione delle regioni interessate e alla disomia uniparentale abbiamo un terzo possibile meccanismo responsabile di queste sindromi, detto DIFETTO DEL CENTRO DELL’IMPRINTING: avviene che, nella fase di resetting, non abbiamo una corretta riprogrammazione del corredo genetico nei gameti, quindi nei figli si presenterà il difetto. Sono difetti per lo più sporadici, ma possono anche essere ereditari in una piccola percentuale dei casi (3-5 % dei casi).

 

DIAGNOSI

La diagnosi viene fatta inizialmente con il test di metilazione: abbiamo detto che uno dei meccanismi di silenziamento genico nell’imprinting è sicuramente la metilazione. Trattando il DNA con Bisulfito, abbiamo che la C si converte in T se non è metilata: viceversa, viene protetta e non si trasforma. Noi disponiamo di primers per la sequenza metilata e di primers per la sequenza non metilata, quindi sapremo dire con facilità se un individuo è normale, perché in tal caso presenterà due sequenze diverse, una metilata ed una non, corrispondenti ai due alleli ereditati rispettivamente dal padre e dalla madre. Se invece viene riscontrata una doppia metilazione o viceversa una doppia non-metilazione nella regione d’interesse sul cromosoma 15, faremo diagnosi di una delle due sindromi. Questa metodica non discrimina però tra la delezione e la disomia uniparentale come cause della patologia; quindi, per farlo, ci si serve della FISH / CGH-array, che “vede” la microdelezione. Questo non è importante solo ai fini di sapere il meccanismo patogenetico preciso, perché ha anche una valenza dal punto di vista prognostico: infatti, nell’Angelman non vi è nessuna correlazione genotipo-fenotipo, mentre nel Prader-Willi se c’è una disomia paterna la patologia è meno grave rispetto a se c’è una delezione; nel primo caso, lo sviluppo è grossomodo normale, e l’obesità è praticamente l’unico aspetto a tenere sotto controllo.

 

CARATTERISTICHE CLINICHE

Sindrome di Prader-Willi

È una patologia soggetta a diagnosi prenatale.

  • ritardo psico-motorio lieve-moderato
  • bassa statura (1.5m)
  • obesità per iperfagia
  • ipogonadismo ipogonadotropo
  • facies tipica con labbro superiore a V rovesciata
  • mani piccole
  • ipoplasia dei genitali

Cause

  • Delezione 15q11-q13 paterna (70%)
  • Disomia uniparentale materna (20-25%)
  • Difetto dell’imprinting (3-5%)
  • Altre anomalie cromosomiche (3-5%)

Sebbene le percentuali di frequenza delle cause siano principalmente del 70 % e del 30 % circa, le forme con una disomia uniparentale sono un pochino più lievi rispetto alle forme da delezione. Sono bimbi che dovranno essere controllati per quanto riguarda l’accrescimento, l’iperfagia, ma tutto sommato possiamo essere abbastanza rassicurati per quel che riguarda la salute mentale.

Sindrome di Angelman

  • ritardo mentale gravissimo con assenza del linguaggio
  • epilessia poco responsiva a trattamento
  • ipotonia
  • tendenza a microcefalia (limiti inferiori di norma)
  • disturbi di coordinazione con andatura atassica
  • disturbi comportamentali e del sonno
  • dimorfismi: prognatismo, denti piccoli e spaziati

Cause

  • Delezione 15q11-q13 materna (70 %)
  • Disomia uniparentale paterna (2-3 %)
  • Mutazione dell’allele materno del gene UBE3A (5-7 %): questo gene si trova sul cromosoma 15 e codifica per l’Ubiquitina Protein-Ligasi 3A. Le mutazioni di questo gene causano difetti nello sviluppo di sinapsi eccitatorie per la riduzione dell’espressione dei recettori AMPA del glutammato. La copia attiva di questo gene si trova solamente sull’allele materno. È una mutazione puntiforme che riproduce un fenotipo Angelman uguale a quello della delezione. L’Angleman è sostanzialmente dovuta ad un malfunzionamento del centro dell’imprinting legato al gene UBE3A.
  • Difetto del centro dell’imprinting (3-5 %)
  • Traslocazioni cromosomiche (2 %)
  • Cause sconosciute (15 %)

È una patologia molto grave, praticamente il ritardo mentale più severo che si conosca; è molto pesante per la famiglia, che si trova di fronte un bambino che praticamente non comunica e non dorme (il ciclo sonno-veglia è completamente alterato). La diagnosi, come abbiamo visto, è relativamente facile da fare: il test della metilazione è veloce e poco costoso. Il dilemma che si pone è se continuare con ricerche su mutazioni del gene UBE3A se c’è negatività del test di metilazione; quel che si fa è cercare di esplorare altre strade, cercando nuove cause, ma in assenza di positività anche del CGH-array si fa comunque una ricerca molto approfondita in questo senso.

 

SINDROME DI BECKWITH-WIEDEMANN E SINDROME DI SILVER-RUSSEL

Queste sono altre patologie dovute ad un difetto dell’imprinting, che coinvolge il cromosoma 11: qui troviamo coinvolto il gene dell’IGF-2 (Insulin Growth Factor 2): sul cromosoma paterno il gene è attivo, sul cromosoma materno invece è imprintato. In particolare, abbiamo un Imprinting Center Bipartito, in ICR1 ed ICR2:

  • sulla zona ICR1 è attivo H19, che si comporta da silenziatore, quindi non permette la sintesi di IGF2
    • nel cromosoma paterno, H19 è metilato, quindi inibito: per tale motivo si ha la trascrizione del gene IGF2
    • viceversa, nel cromosoma materno H19 non è metilato, così svolge la funzione di silenziatore e non si ha la trascrizione di IGF2
  • sulla zona ICR2 avviene la stessa cosa, ma il silenziatore è CDKN1C

Qualsiasi alterazione a livello dei geni citati porterà ad una delle due sindromi. In particolare, la sindrome di Beckwith-Wiedemann è una sindrome da iperaccrescimento: si avrà tutte le volte che viene perso l’effetto del cromosoma materno e prevale quello del cromosoma paterno, con produzione eccessiva di IGF2 (che è un fattore di trascrizione stimolante la proliferazione). Ciò può avvenire con molteplici meccanismi:

  • anomalie di imprinting (55-60 %): ad esempio ipermetilazione di H19 materno, delezioni/ipometilazioni di ICR1 ed ICR2 (1 %) (ricordiamo che metilazione = inattivazione)
  • anomalie citogenetiche (2-3 %)
  • disomia uniparentale paterna del cromosoma 11 (10-20 %)
  • mutazioni dell’allele materno del gene CDKN1C (10 %)
  • cause sconosciute (10 %)

Clinica

  • Iperaccrescimento prenatale
  • Macroglossia
  • Onfalocele (erniazione dei visceri addominali nel canale ombelicale)
  • Visceromegalia
  • Emi-ipertrofia (sproporzione di uno dei due emilati)
  • Aumentata suscettibilità ai tumori infantili, in particolare tumore di Wilms (20-30%)
  • Emangioma frontale

 

La sindrome di Silver-Russel è una sindrome da ipoaccrescimento che si avrà per una ridotta espressione del gene IGF2. Le cause tuttavia sono più variegate rispetto alla sindrome di Beckwith-Wiedemann:

  • alterazione 11p15: ipometilazione della regione di H19-ICR1 (35 % dei casi, è il vero corrispettivo della sindrome di Beckwith-Wiedemann)
  • disomia uniparentale materna del cromosoma 7 o mutazioni a carico del gene GRB10, localizzato sul braccio corto del cromosoma 7 (10-20%)
  • cause sconosciute
  • rare forme AD, AR ed X-linked

Clinica

  • i bambini sono piccoli già alla nascita per ipoaccrescimento prenatale
  • scarso accrescimento, sempre al di sotto del 3° percentile
  • scarso controllo della testa, che cresce normalmente, sproporzionata rispetto al corpo
  • testa “a pera rovesciata” tipica, fronte alta, puntino al centro del mento, angoli della bocca rivolti in basso
  • clinodattilia, camptodattilia, sindattilia
  • dimorfismi urogenitali, come ipospadia e alterazione delle valvole uretrali
  • difficoltà a nutrirsi
  • sintomi gastrointestinali (esofagite da reflusso)
  • aumento sudorazione
  • NON si associa a ritardo mentale (rischio molto molto basso)