Tipizzazione dei microrganismi patogeni

Queste sono alcune tecnologie che il microbiologo utilizza per fare le tipizzazioni, che sono molto importanti per la diagnostica, cioè lo strumento che il laboratorio di microbiologia ha a disposizione per gestire un problema medico o clinico: ad esempio una sospetta diagnosi, la conferma di una eziologia microbica ed eventualmente la definizione di una antibiotico-resistenza.

Oltre a fare una diagnosi microbiologica, quindi la ricerca di un agente eziologico ed eventualmente la definizione di uno spettro di antibiotico-resistenza, può essere fatta la tipizzazione microbiologica, che è in parte biologica e in parte molecolare: si tratta cioè di studi aggiuntivi che in genere vengono fatti dai laboratori di riferimento, o comunque più avanzati per tecnologie ed esperienza, e consentono di arrivare a dati epidemiologici, di stabilire la presenza o meno di un’epidemia, di stabilire la sorgente dell’infezione e di stabilire e distinguere la ricaduta, in un paziente che si ammala per la seconda o terza volta, da una reinfezione, cioè un’infezione di un soggetto nuovo.

Per fare questa tipizzazione esistono una serie di approcci di biologia che prendono in esame il fenotipo del microrganismo, e altri che sono su base molecolare e quindi identificano e lavorano su particolari peculiarità del genoma del microrganismo.
Fare studi di tipizzazione molecolare, di identificazione molecolare o di epidemiologia molecolare significa comparare tra di loro isolati che la microbiologia convenzionale ha riconosciuto come appartenenti alla stessa specie: quando si parla di tipizzazioni si intendono studi ed analisi comparativi tra microrganismi che sono della stessa specie, sono isolati clinici che possono avere diverse origini e quindi si è in grado a definire il grado di parentela, il grado di relazione tra una specie e un’altra.

Ovviamente si parte dall’assunzione che in vitro ogni volta che emerge una singola colonia, quella colonia che il microbiologo può prelevare da un terreno solido è un clone, una popolazione derivata da una stessa cellula.
Questa indagine serve ad analizzare per esempio una serie di isolati clinici appartenenti alla stessa specie, ma ottenuti in momenti non necessariamente simultanei da pazienti in uno stesso ambiente, in una stessa clinica o ospedale: in questi isolati si può fare uno studio molecolare che consente di definire se quel ceppo infettante è unico, allora si parla di EPIDEMIA, o se sono geneticamente non relati e quindi anche clinicamente non relati.
Si può lavorare anche su isolati clinici che sono identici tra di loro, e quindi della stessa specie, ma potrebbero essere ottenuti nello stesso paziente da siti anatomici diversi: questa indagine consente di definire se esiste un unico ceppo infettante che è andato a disseminare e ha colonizzato diversi distretti, oppure se sono isolati clinici diversi, ovvero ceppi con storie biologiche diverse. Questo fornisce dei dettagli molto importanti per capire la patogenesi e per gestire eventualmente la terapia.
Questi studi di tipizzazione vengono fatti su isolati seriali, cioè isolati che vengono ottenuti in tempi diversi da uno stesso soggetto: anche in questo caso è possibile fare indagini biomolecolari che consentiranno di definire il grado di relazione tra quegli isolati clinici e di stabilire se gli eventuali episodi ricorrenti sono da associare al mantenimento di una specie microbica od a nuove infezioni, quindi si distingue una recidiva da nuove infezioni.

 

Come si fanno queste indagini?

Si lavora su colonie che sono state isolate da un campione clinico, cioè si tratta di organismi tutti identici, clonali e tra isolati clinici diversi si fanno studi di comparazione e di correlazione per definire il grado di vicinanza e di similitudine. Queste indagini comparative vengono fatte sia con studi fenotipici, tecniche che si basano quindi sulla ricerca di parametri di tipo fenotipico, sia con indagini di tipo genotipico e molecolare, lavorando quindi sul DNA, sui plasmidi e sui cromosomi.

Esistono una serie di criteri attraverso i quali viene valutata l’efficacia del sistema che si utilizza, sia la tecnica fenotipica che quella genotipica:

  • per la capacità di tipizzare un microrganismo, cioè distinguerne uno dall’altro
  • per il fatto che sia riproducibile, cioè se ripetiamo la stessa indagine più volte riusciamo ad ottenere gli stessi dati
  • sulla base del potere discriminante, cioè di quanto riesce a distinguere i due organismi per anche minime differenze
  • sulla base della facilità di realizzazione e di interpretazione

Esistono quindi questi parametri che valutano le tecniche a disposizione e che le renderanno più o meno efficaci, importanti e più o meno utilizzabili da tutti i laboratori.

 

TECNICHE FENOTIPICHE

Significa lavorare sulla cellula, su come si presenta o come appare la cellula.

  • La Biotipizzazione o Biotyping studia le attività biologiche: la fermentazione di materie e substrati, l’acidificazione di un certo tipo di ambiente per la fermentazione di certi tipi di zuccheri, l’utilizzo di certi substrati, la produzione di certi gas e certe molecole. Funzionano in modo semiautomatico o in modo totalmente automatico, e questo consente di fare una indagine abbastanza efficace e molto approfondita, che però in molte circostanze non è troppo discriminante, cioè spesso tanti isolati clinici anche se sono molto diversi da un punto di vista fenotipico risultano uguali.
  • Un altro modo per fare la tipizzazione fenotipica è la valutazione della suscettibilità ai farmaci antibiotici: quindi lo spettro di antibiotico-resistenza fatto a tutto campo, su tantissime molecole consente di fare studi comparativi e di riconoscere similitudini o differenze tra isolati clinici diversi.
  • Poi c’è la sierotipizzazione: fa parte dei metodi per identificare particolari antigeni, sono studi che vengono fatti con anticorpi monoclonali, in alcune circostanze funzionano abbastanza bene (Pneumococco, Legionelle e Salmonelle), quindi si fa la ricerca di antigeni di superficie, oltre al polisaccaride C della struttura esterna, oppure la proteina M che fa parte della struttura esterna degli streptococchi, servono a fare la sierotipizzazione e consentono di discriminare abbastanza bene entro un certo limite i microrganismi.
  • Un’altra tecnica è la tipizzazione fagica, rientra nelle tecniche utili per fare l’identificazione di una specie. Se si fanno analisi più approfondite queste stesse tecniche consentono di fare in qualche maniera una tipizzazione su base fenotipica. Si utilizzano dei fagi, si parla di una ventina di fagi o forse più: quindi andando a ricercare lo spettro di sensibilità ai fagi, si può fare fare una indagine di tipo fenotipico, quindi una valutazione dell’assetto fenotipico del microrganismo.
  • Le ultime due tecniche sono l’immunoblotting e il Multi Locus Enzyme Electroforesis, cioè due indagini che consentono di riconoscere, se ci sono, differenze sul profilo proteico di questi microrganismi, attraverso delle elettroforesi, quindi delle indagini di tipo molecolare. Per alcuni funziona abbastanza bene, tra questi lo Stafilococco ed il Clostridium Difficile, più spesso si usa questo MLEE che non è altro che un’indagine della presenza di particolari attività enzimatiche in alcuni microrganismi, e siccome queste attività enzimatiche possono variare molto all’interno di una stessa specie, la valutazione di questa indagine può essere un parametro importante per fare la fenotipizzazione di alcune specie microbiche. Questo tipo di indagine è del tipo Western Blotting: si corre in modo elettroforetico in un campo elettrico su un gel di agarosio l’estratto di proteine, però si lavora in condizioni non denaturanti, per cui quelle proteine che prima vengono separate sulla base del loro peso molecolare poi vengono cimentate con i loro substrati: se ci sono delle attività enzimatiche questi substrati vengono catabolizzati e compare una banda, un colore. Il concetto alla base è andare a verificare la presenza di certe attività enzimatiche in alcune specie microbiche e questo aiuta a fare delle tipizzazioni raffinate, quindi a distinguere isolati clinici che magari non sono troppo distinguibili diversamente.

In molte circostanze questi test vengono utilizzati in modo efficace per fare indagini epidemiologiche tra isolati clinici che sono identici tra di loro: sulla base di questi parametri si possono riconoscere differenze anche minime che aiutano a fare un quadro epidemiologico, una sorta di storia di quel particolare tipo di microrganismo. C’è questa batteria di sistemi che il laboratorio ha a disposizione per riconoscere e distinguere tra di loro degli isolati clinici che appartengono a diverse specie microbiche.

 

TECNICHE MOLECOLARI

Nelle tecniche fenotipiche si cercava uno zucchero di superficie, una proteina, un enzima o una farmaco-resistenza, con le tecniche genotipiche invece si lavora sul cromosoma microbico, oppure, laddove è possibile, sui plasmidi. Esistono una serie di protocolli che sono a disposizione per fare tra isolati clinici un confronto sulla presenza o meno di certi plasmidi. I risultati consentono di definire quanto due ceppi siano simili tra loro o differenti. Quali sono i vantaggi ed i limiti di questo sistema? I plasmidi sono unità che si autoreplicano e che possono essere trasferiti facilmente da un organismo all’altro: questo fa sì che se da un lato si fa presto a fare questa indagine, dall’altro lato questo parametro fluttua molto, ed è piuttosto instabile, come caratteristica genotipica, la presenza o meno di certi plasmidi, per questo viene utilizzata solo in poche particolari situazioni.
Oltre alla ricerca dei plasmidi si può lavorare sul DNA, si possono fare 3 o 4 indagini: l’analisi dei frammenti di restrizione, il Southern Blotting con le sonde e la PCR. Sono tutte tecniche molecolari più o meno sofisticate che ci aiutano a definire il grado di similitudine questa volta non tra fenotipi, ma tra il DNA dei diversi microrganismi.

  • Il modo più semplice è il RE o analisi dei sistemi di suscettibilità agli enzimi di restrizione: il DNA batterico viene estratto, viene sottoposto all’attività litica di enzimi di restrizione ed a seconda degli enzimi utilizzati, diversi DNA batterici saranno diversamente tagliati, quindi il pannello di bande che vengono ottenute in una corsa in poliacrilammide fornisce la dimensione ed il numero dei frammenti con cui si può dividere un cromosoma di un batterio e consente di distinguere una specie microbica dall’altra.
  • Poi c’è la RFLP, che è lo studio dei polimorfismi, è simile alla tecnica precedente ma comprende in più l’utilizzo di una sonda radio-marcata, per cui si estrae il DNA batterico, si degrada con gli enzimi litici di restrizione, si fa la corsa elettroforetica e poi si ibridizza il tutto con una sonda marcata (una volta si usava il materiale radioattivo, ora si usa la streptavidina, la biotina, …) e si valuta la comparsa di eventuali bande. Con la presenza di bande identiche gli isolati clinici sono identici, ma se compaiono bande diverse, pur essendo entrambi gli isolati ad esempio degli stafilococchi, ci sono delle differenze molecolari che servono per definire il grado di parentela e di similitudine che c’è tra i diversi ceppi. Questo modo di indagare il DNA ed il cromosoma batterico si può fare a diversi livelli:
    • sul DNA che codifica per il RNA e si chiama Ribotipizzazione, cioè si cerca quella porzione di genoma che codifica per gli RNA (essenzialmente quelli ribosomiali, che sono molto conservati all’interno della stessa specie, ma possono essere anche un motivo di mutazione)
    • si possono cercare delle sequenze di inserzione, anche queste in alcuni batteri sono importanti perché sono quelle che codificano per i geni dei trasposoni
    • si può ricercare la presenza, eventualmente la direzione, di alcuni tratti, di alcuni geni di virulenza che codificano per tossine o per particolari enzimi che sono importanti nella patogenesi e nella storia clinica
  • L’ultima tecnica viene utilizzata solo in particolari laboratori perché è più complicata, si chiama PFGE, cioè Elettroforesi in Campo Pulsato, è simile alla RFLP, però in questo caso si lavora sui cromosomi interi, quindi è un sistema un pochino più complicato che consente di analizzare anche porzioni di DNA di dimensioni decisamente maggiori. Il laboratorio deve avere a disposizione macchinari particolari, però è un sistema che funziona molto bene, è molto efficace, viene utilizzato moltissimo per alcuni batteri come lo Pseudomonas ed i micobatteri. Se le bande sono tutte uguali i ceppi sono tra di loro identici, mentre se sono diverse uno degli isolati potrebbe avere una storia diversa, od un’origine diversa, quindi nella gestione del paziente bisogna avere una attenzione particolare.
  • L’ultima tecnica è la PCR, con tutte le sue variabili: è usata moltissimo nel campo dei virus, oppure in batteriologia ogni volta che si cercano dei batteri particolarmente difficili da trattare, ovvero lenti a crescere, difficili da isolare o impossibili da coltivare. La PCR aiuta nel fare una diagnosi, ma anche per amplificare specifiche porzioni del DNA e fare studi comparativi.

 

Sulla base degli studi molecolari, che siano RFLP, PFGE o PCR, questi studi devono portare il microbiologo a costruire un dendrogramma, ovvero l’acquisizione dell’immagine del gel e dei prodotti che si ottengono dall’esperimento potranno essere analizzati da un sistema che fornisce il grado di omologia.

La tipizzazione molecolare è un modo per fare un profilo di indagine del DNA, più raramente di plasmidi, e in questa maniera si può definire il grado di similitudine tra isolati clinici che appartengono allo stesso ceppo e che quindi con la diagnostica convenzionale forniscono lo stesso risultato.

  • Se non ci sono distinzioni molecolari certamente è lo stesso ceppo
  • Se c’è un singolo evento i microrganismi sono strettamente correlati tra di loro, di conseguenza si assume che probabilmente siano all’interno di un cluster epidemico
  • Se ci sono due differenti eventi genetici i microrganismi sono probabilmente relati, ma non si tratta necessariamente di una epidemia
  • Se le differenze sono più di tre si dice che i ceppi sono decisamente tra di loro distinti

Gli studi di tipizzazione servono per stabilire il grado di similitudine, di parentela e di relazione che intercorre tra un ceppo e l’altro e quindi consente di distinguere tra le epidemie ed i casi sporadici, o i casi acquisiti, in maniera del tutto autonoma.