Test ELISA per la diagnosi di HIV

Lo screening iniziale, la diagnosi iniziale quando si vuol sapere se un individuo è infetto o meno da HIV, è un test E.L.I.S.A., un test E.L.I.S.A. particolare, definito di IV generazione, in quanto non solo permette la ricerca degli anticorpi contro il virus: sul fondo del pozzetto della piastra sono presenti antigeni ricombinanti del virus, che reagiscono con Anticorpi-antivirus, ma è anche presente un anticorpo monoclonale contro la p24.

E.L.I.S.A. serve quindi sia per la ricerca degli anticorpi grazie agli antigeni ricombinanti sul fondo del pozzetto, sia per la ricerca di antigeni capsidici come la la p24, questo rende il test estremamente sensibile ma anche molto più specifico rispetto ai precedenti test E.L.I.S.A che erano una semplice ricerca di anticorpi. Uno dei limiti dell’E.L.I.S.A. come test sierologico è una certa carenza in specificità, in quanto mette in evidenza anche dei falsi positivi.

Cioè, essendo così poco specifica, può dare dei risultati positivi per la reazione con degli anticorpi che in realtà non sono specifici contro il HIV, si ha in questo caso una cross-reattività.

I test di ultima generazione hanno una specificità molto migliorata, danno meno falsi positivi, ciò nonostante il risultato positivo in E.L.I.S.A. deve comunque sempre essere confermato con un test Western Blot. Con la semplice E.L.I.S.A. non si fa mai la diagnosi di HIV, qualsiasi siero risulti positivo o anche solo reattivo in ELISA, anche se si è a cavallo della zona di cut-off, di limite, nella zona grigia. Un siero francamente positivo come un siero dubbio dev’essere confermato e il test di conferma è la Western Blot. La Western Blot ha delle caratteristiche opposte rispetto l’E.L.I.S.A. (la cui sensibilità è prossima al 100 %), in quanto è molto meno sensibile, non può essere utilizzato come test di screening in quanto darebbe dei falsi negativi, ma invece è estremamente specifico, non darà mai dei falsi positivi.
Per confermare il risultato in E.L.I.S.A. si deve avere una positività per almeno due bande della Western Blot. In questo test si mettono in evidenza degli anticorpi contro le varie proteine virali, sulla striscia di nitrocellulosa alla fine si hanno delle bande scure ed a seconda del tipo di banda si interpreta il risultato.

Ci sono tutti gli antigeni del virus, dalla gp160 fino alla p7, si possono evidenziare tutti i tipi di anticorpi presenti nel siero e contro quali Ag questi risultano essere diretti. Non basta una banda, o un corredo di bande qualsiasi, ma devono essere presenti alcune bande specifiche per poter dare il risultato positivo. Ci devono essere almeno due bande tra la gp160, la gp120, la gp41 e p24, cioè perlomeno due di queste tipologie di anticorpi devono essere positivi.
In caso di ELISA positivo o dubbio e di Western Blot negativo viene chiesto di fare un secondo prelievo a una distanza di una settimana, una decina di giorni, in quanto il paziente può essere nella fase di sieroconversione, nella fase detta periodo finestra, ovvero quel periodo che intercorre dall’avvenimento della infezione alla comparsa degli Ac che possono essere messi in evidenza con i test disponibili. Tale periodo nel caso del HIV è particolarmente lungo e può andare da 2-3 settimane, fino a 40-60 giorni dalla contrazione della infezione. Il test in questo periodo può essere francamente negativo oppure dare un risultato ELISA+ o dubbio (che essendo molto sensibile si positivizza prima) e un esito in WESTERN-.

 

Questo è l’iter diagnostico in situazioni normali, protocolli diversi invece si attuano in caso di esposizione accidentale al virus, oppure sulle sacche di sangue per le trasfusioni, oppure ancora nei bambini nati da madri sieropositive. Un bambino nato da una madre sieropositiva avrà gli anticorpi materni ricevuti per via transplacentare con l’immunità passiva naturale, la diagnosi sierologica in questo caso non avrà ovviamente alcun valore diagnostico in quanto sarà positivo.
Si procede con metodi di diagnosi diretta andando a ricercare direttamente l’RNA virale, cosa che si fa anche sulle sacche di sangue. Esistono 2 metodiche che possono essere utilizzate: andare con la PCR a ricercare il cDNA nei linfociti, e questo porta ad un accorciamento del periodo finestra fino a circa 20 giorni, oppure si realizza un ulteriore accorciamento se si ricerca l’RNA virale libero nel plasma, ed in tal caso la media del periodo finestra si abbassa a circa 10-15 giorni. Nessuna metodica fornisce la certezza di assenza dell’infezione, questo è un rischio importante da considerare nelle sacche di sangue. Per quanto riguarda i bambini nati da madri infette si fa la ricerca del DNA provirale in vari momenti, al momento della nascita ed a 1-3-6-12 mesi di distanza. Viene fatta una diagnosi di infezione neonatale se consecutivamente 2 di queste PCR risultano positive. Se a 12 mesi il bambino è rimasto negativo significa che non è avvenuta la trasmissione verticale della infezione.

Il paziente, dopo questi test, una volta che è stata accertata la sieropositività, non viene lasciato a se stesso ma viene sottoposto a un monitoraggio virologico e immunologico. Il monitoraggio immunologico è essenzialmente il numero assoluto in percentuale dei CD4 e dei CD8 (per valutare lo stato clinico del paziente), mentre il monitoraggio immunologico riguarda la determinazione della carica virale plasmatica, cioè quanto virus c’è in circolo, viene fatto misurando l’RNA virale plasmatico attraverso varie metodiche di biologia molecolare. Sono metodi estremamente sensibili, che hanno come soglia minima 40-50 copie di RNA per ml di plasma, valori estremamente bassi.

Non solo sono molto sensibili, ma sono anche molto affidabili per quanto riguarda le variazioni, ovvero una variazione di 0,5 logaritmi viene considerata attendibile: se con un test da un prelievo all’altro si vede un aumento di mezzo logaritmo è considerato reale, non un semplice effetto della variabilità del sistema, e indica che c’è stato un aumento effettivo della carica virale.

 

Un altro aspetto importante è valutare quando è opportuno iniziare la terapia. Si utilizzano soprattutto parametri in questo caso immunologici, il criterio più importante è il numero dei CD4, i criteri utilizzati vengono continuamente aggiornati, al giorno d’oggi si inizia la terapia attorno ai 300-350 CD4.
E’ importante stabilire in quale momento deve essere effettuata la terapia, dato che si tratta di terapie croniche con effetti collaterali anche molto pesanti, ciò implica quindi che più tardi verrà effettuata la terapia e minore sarà il danno all’organismo.
Un altro aspetto è poi anche quello dell’insorgenza delle resistenze alla terapia, prima si comincerà la terapia e prima insorgeranno i mutanti resistenti. Non si può tuttavia aspettare che il paziente muoia o che sia in grave deficit immunitario, considerando soprattutto lo stato di continua attivazione del sistema immunitario, comunque anche se il soggetto ha buoni valori di CD4 ed un buon controllo della carica virale ovviamente questa infiammazione protratta ha i suoi danni.

 

Un altro aspetto importante è la valutazione della efficacia della terapia. L’efficacia della terapia antiretrovirale è basata proprio su parametri immunologici (il ripristino di valori di CD4 al di sopra delle 500 cellule per mm cubo di sangue) e virologici (azzeramento della carica virale).

Un ulteriore aspetto nell’attività di laboratorio per i pazienti HIV è il monitoraggio delle resistenze, cioè tutte le volte che si ha un aumento della carica virale di almeno 0,5 logaritmi si ipotizza un fallimento terapeutico, ovvero la terapia non è più efficace in quanto il virus è diventato resistente a tutti i farmaci compresi in quel determinato protocollo. È importante prima di iniziare la terapia e durante il monitoraggio della terapia periodicamente fare la valutazione delle mutazioni presenti sul virus infettante e valutare se ci sono mutazioni associate alla farmaco-resistenza.