Test ELISA e di agglutinazione in microbiologia

Il percorso diagnostico è abbastanza lungo e comincia nel momento in cui si fa il prelievo.
È importante il tipo di prelievo, a valle di questo ci sarà la diagnosi diretta e/o la sierologica e sarà possibile arrivare ad un referto preliminare anche a poche ore di distanza. Il secondo giorno ci sarà un ulteriore risultato provvisorio ed infine il terzo giorno si arriva al referto finale. È molto importante il momento dell’anamnesi, in alcune malattie infettive i sintomi sono molto chiari e netti e quindi il medico si orienta subito, in molti casi però c’è solo la febbre o il malessere e le cause potrebbero essere virali, batteriche, tossiche, infiammatorie, … .

In alcune circostanze è più difficile indirizzare le indagini in modo preciso. Bisogna saper scegliere il campione clinico e conoscere i microrganismi che sono presenti come commensali nei vari distretti anatomici. Ci sono dei distretti dell’organismo che devono essere sterili, quindi i campioni biologici raccolti in quei distretti non devono presentare microrganismi: se ci sono, rappresenteranno l’agente eziologico di quel particolare caso clinico. In altri siti anatomici c’è invece un microbiota residente, quindi i campioni prelevati da questi distretti sono più complessi da gestire, bisogna escludere il microbiota residente e fare emergere il patogeno clinicamente rilevante. Bisogna raccogliere il campione giusto, l’indagine deve essere accurata: non è più possibile fare “esami a tappeto” perché i costi non lo permettono, si richiede dunque al medico e allo specialista di fare una selezione attenta del campione microbiologico più rappresentativo.
È fondamentale il momento in cui il prelievo viene effettuato perchè per alcune malattie infettive non sempre i microrganismi sono presenti in tutti i distretti anatomici nella stessa maniera e quantità. Deve esserci abbastanza materiale nel prelievo, perché si rischia di fare delle sottostime. Bisogna evitare le contaminazioni al momento del prelievo da parte della flora batterica residente o da parte dell’operatore se i mezzi non sono sterili. La scelta di un sistema di trasporto non idoneo per il campione biologico, dal luogo del prelievo al laboratorio, può inficiare tutto il percorso diagnostico. Inoltre bisogna evitare di fare un prelievo dopo la somministrazione dell’antibiotico da parte del medico.

Una volta che il campione è arriva in laboratorio, si procede nel seguente modo:

  1. esame macroscopico: in alcuni casi è utilissimo, ad esempio quando si devono esaminare il liquor o le feci. Il liquor sano è limpido, se è torbido significa che sono presenti batteri e cellule infiammatorie, le feci dei pazienti con il colera invece non hanno nulla a che vedere con le feci normali né come colore né come consistenza, tanto che vengono chiamate “ad acqua di riso”
  2. esame microscopico: tutti i laboratori di microbiologia sono dotati di microscopi ottici, tramite i quali ci sono quattro possibili opzioni per osservare i campioni:
  • luce diretta/campo luminoso
  • contrasto di fase
  • fluorescenza (in questo caso è necessario che il microscopio abbia un sistema per acquisire la luce ultravioletta)
  • campo oscuro

Il potere di risoluzione del microscopio ottico permette di osservare strutture le cui dimensioni vanno dal micron di diametro in su. Nelle strutture più all’avanguardia ci sono anche i microscopi elettronici, che possono essere a scansione o a trasmissione.

  1. test rapidi (come la ricerca di Ag o di sequenze geniche): sono test che nel giro di un’ora al massimo danno delle indicazioni molto importanti
  2. appropriate colture

 

Test non colturali (rapidi)

Dopo l’esame al microscopio ottico si può procedere con questi test, che in tempi brevissimi sono in grado di fornire informazioni importanti. In particolare, i test rapidi consentono di:

  • Determinare i prodotti microbici (ad esempio con la cromatografia gas-liquida)
  • Ricercare antigeni (ad esempio con l’agglutinazione o l’ELISA)
  • Ricercare esotossine
  • Ricercare endotossine

 AGGLUTINAZIONE

Serve per la ricerca di antigeni solubili di natura polisaccaridica. Il test sfrutta quel fenomeno spontaneo per cui se ci sono delle particelle di lattice (quindi inerti) ricoperte da anticorpi monoclonali specifici contro un certo microrganismo e a queste si aggiunge un campione biologico, se c’è complementarietà tra l’Ag e gli Abs si forma un aggregato tridimensionale (dovuto al fatto che l’Ag e gli Abs si combinano). Il reticolato che si forma è facilmente visibile e si forma in 5/10 minuti. In questo modo si diagnosticano l’infezione da Streptococco beta-emolitico, un piogeno pericoloso nell’età pediatrica, e da Stafilococco aureo.

CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDA

È un esame più impegnativo (si allungano anche i tempi tecnici ed aumentano i costi) che evidenzia gli acidi grassi, i prodotti finali del metabolismo microbico. Consente di arrivare ad un grafico detto cromatogramma, che mette in funzione del tempo di ritenzione di una colonnina la quantità di materiale che fuoriesce, per cui consente di vedere in cinetica che sostanze escono una volta che un campione biologico viene inoculato nella colonnina del sistema cromatografico. Questo test consente di separare le diverse sostanze sulla base della capacità di ritenzione delle resine presenti in una colonnina. I picchi corrispondono a specifiche molecole.

TEST ELISA

Serve per la ricerca di antigeni particolari mediante anticorpi marcati con enzimi. Prevede che vengano spottati sul fondo di un pozzetto degli Abs che vengono fissati in modo covalente con la regione Fc e hanno la porzione variabile rivolta verso l’esterno. Si aggiunge il campione biologico e se questo contiene l’Ag complementare questo si legherà alla regione variabile dell’Ab. Viene poi aggiunto un altro Ab, marcato con un enzima (perossidasi o fosfatasi) che riconosce a livello di un epitopo diverso lo stesso Ag. Se il pozzetto si colora, significa che l’Ab secondario si è legato all’Ag e che quindi l’Ag si era legato al sistema di cattura che c’è sul fondo del pozzetto.

RICERCA DI TOSSINE

Per identificare le esotossine, cioè le proteine con attività tossica, è possibile:

  1. Inoculare il campione biologico nel topo che nella peggiore delle ipotesi muore oppure può mostrare sintomi particolari a seconda del tipo di tossina (colera, tetano, …)
  2. Inoculare le tossine in campioni cellulari sensibili, quindi le cellule cambieranno morfologia e struttura, andranno incontro a cambiamenti nucleari e citoplasmatici, tutti effetti citopatici che aiutano a dimostrare la presenza della tossina stessa
  3. Sfruttare la reazione di agglutinazione ricoprendo le particelle di lattice con gli Abs anti-tossina

Per identificare le endotossine, cioè quei polisaccaridi attaccati alla parete batterica dei Gram- (ad esempio il LPS), esiste il test di Limulus.