Prelievo del midollo osseo e analisi

Il tessuto emopoietico si sviluppa lentamente durante l’embriogenesi seguendo tre fasi corrispondenti a tre sedi anatomiche diverse:

  • Sacco vitellino: dal giorno 19 alla 9° settimana
  • Fegato fetale: dalla 6° settimana a termine (nel neonato, infatti ci sono ancora i microciti prodotti dall’eritropoiesi fetale)
  • Midollo emopoietico: in particolare la matrice midollare si forma:
    • All’8° settimana nella clavicola
    • Dalla 9° alla 10° settimana nelle ossa lunghe
    • Dalla 10° ed 11° settimana in avanti il midollo diventa emopoietico


Quindi, nel soggetto adulto, si trova:

  • Nella cavità delle ossa lunghe
  • Negli interstizi delle trabecole delle ossa spugnose
  • Nella ossa piatte

Si parla di midollo osseo rosso, quando ci si riferisce al midollo emopoietico, e di midollo osseo giallo, quando è presente un abbondante stroma adiposo di sostegno:

  • Nel neonato è presente solo midollo rosso
  • Dopo i 20 anni il midollo rosso permane solo in alcune zone

 

Ematopoiesi: iter differenziativo delle cellule nel midollo osseo

Nel midollo osseo si trovano anche i precursori immaturi di tutte le linee emopoietiche (mielopoietiche e linfopoietiche). Entrambe, infatti, derivano da un progenitore comune, per poi finire il loro iter in organi differenti:

  • La linfopoiesi vede la fine del suo sviluppo negli organi linfoidi periferici.
  • La mielopoiesi si sviluppa nel midollo. Qui si ha una differenziazione in:
    • Linea granulocitaria
    • Linea eritro-megacariocitica

 Caratteristiche del midollo osseo adulto:

  • 4,7 ± 3 % del peso corporeo (1,5 – 3,7 kg)
  • Un quarto è midollo rosso emopoietico (500 – 700 g)
  • È localizzato nel:
    • Scheletro assiale
    • Ossa piatte
    • Epifisi
  • Ha una struttura composta da:
    • Trabecole ossee che circoscrivono delle lacune
    • Endostio: membrana che riveste le trabecole all’interno
    • Sinusoidi: sistema vascolare interno del midollo
    • Stroma reticolare
    • Grasso
  • Cordoni emopoietici da 10¹² cellule

 

Studio diagnostico del midollo osseo

Il midollo osseo viene studiato da più di un secolo (alcune tappe storiche):

  • Pianese 1903: trapanazione del femore su cadaveri
  • Arinkin 1927: prima puntura dello sterno in vivo (utilizzando un ago per puntura lombare). Anche se fu un intervento molto pericoloso, si trattò del primo esame diagnostico (oggi non è più praticato)
  • Jamshidi anni ’70: introduzione di modelli dedicati di aghi da puntura midollare e per l’esame istologico
  • Anni ‘80 e ‘90: perfezionamento degli strumenti, utilizzati anche per biopsie a cielo coperto
  • Oggigiorno: il prelievo di midollo è eseguito con aghi specifici

Fino a qualche decennio fa il prelievo era eseguito sullo sterno, ormai non è più indicato come sede elettiva per questioni medico-legali: sotto lo sterno sono presenti strutture molto delicate (pericardio, …) ed una loro eventuale perforazione potrebbe essere molto pericolosa (anche se la sede di prelievo sternale ottimale è sull’angolo di Lewis, sotto al quale si trova solamente il grasso del mediastinico). Si ricorre allo sterno, comunque solamente nei casi in cui non vi siano altre possibilità (come i pazienti che hanno subito un trattamento radiante nelle sedi elettive).

Le sedi elettive nelle quali viene effettuato il prelievo oggi sono:

  • Nell’adulto la cresta iliaca postero-superiore
  • Nel bambino piccolo la tibia (a questa età le ossa lunghe sono ancora ematopoietiche)

È da osservare, che i mieloaspirati ottenuti dalle punture dello sterno erano più ricchi di cellule emopoietiche di quelli ottenuti dalla cresta iliaca postero-superiore (non se ne conosce a fondo il motivo, forse dipende dal fatto che a livello sternale era necessario essere più precisi nella manovra).

L’esame del midollo si fa con due modalità:

  • Citologica: qui si deve eseguire un agoaspirato
  • Istologica: qui si esegue una biopsia osteomidollare

Biopsia del midollo osseo,bacino,ago

Questi esami mostrano cose diverse e sono complementari (infatti, in genere si fanno entrambe):

  • Agoaspirato: si utilizza per eseguire un’analisi citologica del midollo osseo
    • Materiale ricavato:
      • Piccoli gruppi di cellule adese allo stroma adiposo (frustoli)
      • Cellule emopoietiche libere
      • Sangue sinusoidale con cellule mature
    • Preparazioni e studi possibili:
      • Colorazioni panottiche (per evidenziare tutte le caratteristiche delle cellule del sangue)
      • Citochimica
      • Immunofenotipo
      • Citogenetica
      • Biologia molecolare
      • Test microbiologici

Il prelievo deve essere al massimo di 0,2 – 0,3 ml: è necessario che vi sia poco materiale aspirato, altrimenti si ottiene soltanto il sangue dei sinusoidi. Se occorre molto materiale per eseguire altri esami (immunofenotipo, citogenetica, …) deve essere prelevato con un’altra siringa.

Gli anticoagulanti ideali sono:

  • EDTA
  • Citrato trisodico

Bisogna tener presente che il sangue midollare è più concentrato di quello periferico, e quindi rischia di coagulare molto più velocemente.

  • Biopsia osteomidollare: da cui si può eseguire un’analisi istologica:
    • Materiale ricavato: cilindretto di tessuto midollare intatto, con la conservazione delle varie strutture
      • Cellulari
      • Vascolari
      • Ossee

Si conservano anche le loro reciproche relazioni (i rapporti delle cellule tra loro). A differenza di quello che si può vedere dal mieloaspirato, in cui le cellule non mantengono un loro ordine, ma si dispongono in modo casuale.

  • Preparazione del preparato istologico:
    • Fissazione
    • Decalcificazione
    • Inclusione (paraffina o plastica)
    • Sezione
    • Colorazione
    • Immunoistochimica

Il microambiente è, infatti, molto rigoroso per quanto riguarda le posizioni e gli spazi che occupano le varie serie (c’è un ordine preciso):

  • La serie granulocitopoietica: si sviluppa nella zona peritrabecolare, poi raggiunge la zona centrolacunare via via che la maturazione prosegue
  • Isolotti eritropoietici: sono compatti
  • Megacariociti: sono dispersi nella lacuna

Proprio perché l’ordine rigoroso è sempre rispettato, se si notano delle variazioni, si deve cercare di capire a cosa possono essere dovute.

Le indicazioni a uno studio del midollo osseo sono diverse:

  • Emopatie in senso lato: per i più vari motivi
    • Controllo di una leucemia già diagnosticata
    • Stadiazione di un linfoma
    • Diagnosticare una malattia mieloproliferativa cronica

Per le anemie, invece, il midollo non è quasi mai necessario, perché si hanno numerosi elementi per arrivare alla diagnosi (morfologia eritrocitaria, reticolociti, dati di laboratorio, …) anche senza il mieloaspirato (è inutile fare un esame quando il suo risultato è prevedibile). L’unica eccezione è data nei casi di una malattia linfoproliferativa che sostiene un’anemia emolitica autoimmune, o in casi di sospetto di anemia sideroblastica.

  • Citopenie inspiegate: nelle situazioni in cui non si trova una ragione clinica per cui il paziente sia citopenico, è indicato fare lo studio del midollo osseo perché si potrebbe avere una causa midollare
    • Mielodisplasia
    • Mieloftisi
  • Febbri indeterminate: una volta esclusi tutti i processi che possono decorrere con la febbre
    • Emocolture negative
    • Test per le vasculiti negativi
  • Lesioni scheletriche patologiche: le lesioni osteolitiche possono nascondere un mieloma multiplo od altre patologie ematologiche.

È vero che le due tipologie di test danno informazioni diverse e tra loro complementari, e che spesso sono eseguiti entrambi proprio per questo motivo, però è giusto distinguere i casi in cui è opportuno eseguire un esame piuttosto che l’altro:

  • Esame citologico:
    • Necessità di vedere le cellule nel loro dettaglio per osservare ogni cellula (diagnosi delle mielodisplasie, nelle leucemie acute…)
    • Con questa modalità la reazione di Perls è più affidabile (diagnosi di anemia sideroblastica). La reazione di Perls può essere fatta anche in istologia però, i sideroblasti ad anello, nelle sezioni in paraffina, non si vedono (si vedono, forse, solo nelle sezioni incluse in plastica, ma queste non sono normalmente usate).
  • Indagini citochimiche

 

In realtà con le tecniche di citometria è possibile ottenere informazioni molto precise sulla leucemia che si sta esaminando, ma in casi in cui sia necessario avere un inquadramento iniziale generale, si va a fare uno studio citologico. In particolare, se si sospetta la natura linfoide di una leucemia, si utilizza il PAS, se invece si sospetta la natura mieloide si utilizza il Sudan (quando non ci sono segni di differenziazione si fanno entrambi).

  • Esame istologico: è importante per mettere in evidenza le lesioni solide (ad esempio nelle stadiazioni dei linfomi)
    • Consente una buona valutazione quantitativa (se i rapporti tra lo stroma adiposo e le varie cellule sono mantenuti). In effetti la sola quantità si può valutare anche nel mieloaspirato, però, in questo caso, è più soggettiva, cioè dipende da come è stato fatto l’aspirato
    • È necessaria per la diagnosi delle neoplasie solide midollari (linfomi e carcinomi) e nelle granulomatosi
    • Si può conservare per successive valutazioni (nuovi MoAb…)
    • È importante per una migliore standardizzazione
    • Immunoistochimica

Queste sono alcune patologie in cui è utile una biopsia osteomidollare:

  • Valutazione accurata della cellularità
  • Punctio sicca o scarsa
  • Fibrosi, necrosi ed atrofia sierosa
  • Lesioni focali
  • Citoarchitettura
  • Granulomatosi
  • MPD (in particolare la Mielofibrosi): se si tenta di fare un mieloaspirato si ottiene la punctio sicca, cioè la fibrosi impedisce alle cellule di uscire
  • Aplasie ed Emoglobinuria Parossistica Notturna (EPN)
  • Stadiazione di linfomi e malattie linfoproliferative
  • Gammopatie monoclonali e mieloma: si ha una maggior accuratezza (con il mieloaspirato, a volte non è possibile fare la diagnosi)
  • Carcinomi ed altre neoplasie solide
  • Leucemie acute ipocellulari

Il prelievo viene fatto dalle spine iliache postero-superiori: qui la quantità di cellule emopoietiche varia secondo l’età del soggetto

  • A 20 – 30 anni è del 60-70 %
  • A 40 – 60 anni è del 40-50 %
  • Per età superiori ai 70 anni è del 30 – 40 % (tende via via a calare)

Si tratta ovviamente di valori di riferimento, ma è importante conoscerli per definire se un midollo rispetto all’età è ipercellulare od ipocellulare.

 

 

Esame del midollo osseo

 

Ematopoiesi,midollo osseo,cellule staminali mieloidi,linfoidiNel midollo, oltre alle tre serie (eritroide, granulocitica e megacariocitica) ci sono anche numerose cellule accessorie, sono da conoscere per non confonderle con elementi atipici:

  • Osteoclasti ed osteoblasti occasionali: normalmente non sono presenti, ma con la puntura, andando a pungere l’endostio, possono comparire (danno comunque informazioni utili)
  • Osteoclasti: cellule polinucleate, assomigliano per dimensione e colore ai megacariociti
  • Osteoblasti: si trovano più spesso a gruppi, hanno il nucleo eccentrico ed il citoplasma basofilo, potrebbero essere confusi con le plasmacellule, ma il citoplasma qui non è soltanto basofilo, ma anche finemente granuloso (a differenza delle plasmacellule)
  • Monociti (0 – 3 %): nascono nel midollo, ma ben presto vanno a localizzarsi in circolo, ecco perché normalmente ve ne sono pochi a livello midollare
  • Macrofagi (< 2 %): sono generalmente scarsi, non sempre visibili, ma in questo caso specifico il paziente aveva subito un trattamento per una leucemia acuta e presenta macrofagi ripieni di materiale fagocitato
  • Linfociti (3 – 15 %): nell’immagine si può vedere un piccolo aggregato di linfociti
  • Plasmacellule (0 – 3 %)
  • Mastcellule (occasionali)
  • Cellule anomale: a volte capita di trovarle, si tratta di cellule endoteliali che derivano dai vasi, probabilmente, distrutti durante l’aspirazione
  • Cellule atipiche: a volte, tra le cellule accessorie, si possono vedere queste cellule atipiche, binucleate, di forme varie possibili

 

 

 

Il mielogramma

Per eseguire correttamente un mielogramma occorre avere uno striscio di sangue midollare strisciato come il sangue periferico normale, e seguire tutti i criteri. In realtà di solito si utilizzano i “frustoli” che derivano dalla puntura e che vengono appoggiati con le pinzette sul vetrino: questo crea una distribuzione delle cellule anormale, con la presenza di cellule danneggiate, che non si riescono a riconoscere.

Il primo criterio di studio è controllare il rapporto tra la linea granulocitaria ed eritropoietica. Normalmente è a favore della granulocitopoiesi, inoltre grazie a questo parametro si possono notare abbastanza bene delle variazioni ampie della funzionalità midollare. Ad esempio:

  • In caso di malattie mieloproliferative croniche (come la leucemia mieloide cronica) il rapporto G / E risulta essere più di 50
  • In caso di infezioni il rapporto si sposta verso i limiti superiori dell’intervallo
  • In caso di anemia emolitica, invece, si ha una riduzione del rapporto

Per quanto riguarda gli elementi costituenti del midollo, si ha un effetto piramide: le cellule più immature sono meno numerose, e man mano che maturano, aumentano di numero. Normalmente si contano le linee cellulari, rispetto alla cellularità totale.

 

Tappe maturative delle cellule nel midollo osseo: linea eritroide

  • Proeritroblasto: sono cellule immature, con un grande nucleo e numerosi nucleoli, con la cromatina molto indifferenziata (non aggregata a zolle).

Hanno dimensioni più grosse rispetto ai precursori della linea granulocitica, c’è un’intensa basofilia (si vede un “bordo” quasi più scuro del nucleo). Già a questo livello inizia la sintesi dell’emoglobina, man mano che aumenta la sua concentrazione, il colore dell’eritroblasto muta da blu ad arancione.

  • Eritroblasto basofilo: abbiamo la cromatina che si addensa via via di più fino ad assumere il tipico aspetto “a zolle”, è comunque mantenuta l’intensa basofilia.
  • Eritroblasto policromatofilo: c’è un citoplasma che da blu assume colori più tendenti al grigio (abbiamo la competizione tra l’RNA residuo e l’emoglobina che comincia ad accumularsi). È l’ultima cellula della catena differenziativa in grado di andare in mitosi (le tappe successive hanno il solo scopo di produrre l’emoglobina ed espellere il nucleo).
  • Eritroblasto ortocromatico: abbiamo la cromatina organizzata a zolle molto dense, fino a diventare un unico “pallino scuro”. È il momento dell’espulsione del nucleo.
  • Reticolociti: man mano che l’eritroblasto ortocromatico matura, si ha l’espulsione del nucleo e la formazione dei reticolociti che in qualche giorno matureranno in globuli rossi maturi.

Gli isolotti eritropoietici sono composti da un macrofago centrale, sulle cui propaggini si appoggiano gli eritroblasti, che ricevono i fattori nutritivi e maturano.

Le tempistiche di maturazione dei globuli rossi:

  • Il passaggio da eritroblasto a reticolocita dura 4 giorni circa (si hanno 4 divisioni mitotiche)
  • Espulsione del nucleo
  • Il reticolocita matura in 3 giorni
  • Il globulo rosso in circolo ha 120 giorni di emivita

Collegato allo studio della linea eritropoietica è opportuno sottolineare che sul midollo osseo si può effettuare anche la reazione di Perls per evidenziare i depositi di ferro (in realtà prima che fosse disponibile il dosaggio della ferritinemia si ricorreva molto più spesso a questa reazione). Lo scopo di questa reazione è di mettere in evidenza eventuali sideroblasti ad anello.

 

I sideroblasti sono eritroblasti che contengono ferro e vengono classificati in vari modi.

Secondo la classificazione francese si hanno 3 tipologie:

  • Tipo I: contengono micelle di ferritina visibili solo in microscopia elettronica; normalmente (in un soggetto sano) sono circa il 60 % gli eritroblasti totali. Non sono visibili al microscopio ottico ma possono essere messi in evidenza anche con gli anticorpi anti-ferritina
  • Tipo II: contengono agglomerati di micelle di ferritina visibili al microscopio ottico, sono dispersi nel citoplasma, non sono patologici, ma sono l’espressione di un sovraccarico di ferro (presenti nelle anemie emolitiche, nelle talassemie, …)
  • Tipo III: contengono agglomerati di micelle di ferritina all’interno dei mitocondri (sono i veri sideroblasti patologici, detti sideroblasti ad anello). Sono cellule che presentano una specie di “coroncina” di granuli di ferro, che si colorano in verde e che circondano il nucleo

La forma ad anello è dovuta alla ferritina che infarcisce i mitocondri situati nella regione iuxtanucleare (formando quindi una specie di anello).

Queste cellule sono tipiche delle anemia sideroblastiche, che possono essere divise in 2 tipologie:

  • Congenite
    • Legata al cromosoma X
    • Autosomica recessiva
    • Sindrome di Pearson: rara, associata ad una neutropenia e ad un difetto del pancreas esocrino, è dovuta a un difetto del DNA mitocondriale
  • Acquisite
    • Sindromi Mielodisplastiche (MDS): anemia sideroblastica, detta anche anemia refrattaria con sideroblasti ad anello
    • Forme tossiche:
      • Da etanolo
      • CAF (cloral-fenicolo)
      • Piombo
      • INI: utilizzata nei trattamenti antitubercolari
      • Carenza di rame: ad esempio nei trattamenti con una nutrizione parenterale cronica, in cui non si è fornito tutti i metalli necessari

Queste forme tossiche sono comunque tutte responsive al trattamento con vitamina B6, il substrato della catena di reazioni della sintesi del gruppo EME (accumulando il substrato si può sbloccare l’intera via).

 

Tappe maturative delle cellule del midollo osseo: serie granulocitaria

  • Mieloblasto: cellula con cromatina immatura, elevato rapporto nucleo/citoplasma e lievemente basofila
  • Promielocita: cellula piena di granulazioni azzurrofile (sono le prime granulazioni che si formano), da questo momento in poi cessa la sintesi di queste granulazioni
  • Due generazioni di mielociti: sono le ultime cellule in grado di andare in mitosi

I mielociti hanno taglie diverse, e la zona chiara indica la formazione delle granulazioni secondarie

  • Metamielociti: inizia a segmentari il nucleo
  • Band-cel
  • Neutrofili maturi

Quando in un mieloaspirato se si vedono molti neutrofili bisogna allarmarsi (normalmente sono pochi): può essere avvenuta una contaminazione col sangue sinusoidale, o per qualche ragione non vengono normalmente dismessi.

Le tempistiche della maturazione mieloide:

  • Mieloblasto: 1 giorno
  • Promielocita: 2 giorni
  • Mielocita I: 2 giorni
  • Mielocita II: 2 giorni
  • Metamielocita: 2 giorni
  • Granulocita:
    • 2 giorni come band cel
    • Circa 5 giorni in forma segmentata (di questi solo 8 ore nei vasi)

Ci sono dei casi di blocco maturativo mieloide (ad esempio l’agranulocitosi acuta da farmaci), per questo è importante sapere quanto è necessario attendere per arrivare allo sviluppo completo della granulopoiesi: nel complesso il tempo totale è circa di una settimana.

Gli eosinofili, a differenza dei neutrofili, hanno un’unica granulogenesi: i loro precursori sono facilmente distinguibili in quanto i granuli hanno le stesse dimensioni ma con colori differenti.

 

Tappe maturative delle cellule nel midollo osseo: linea megacariocitica

Normalmente il megacariocita è una cellula iperdiploide: nasce come cellula diploide, come tutti gli altri elementi figurati del midollo, poi duplica il patrimonio cromosomico senza effettuare la mitosi (raggiunge una poliploidia media di 16 – 32).

  • Promegacariocita: è molto più grande delle altre cellule midollari
  • Megacariocito basofilo: inizia a granuleggiare ed a produrre quelle che saranno poi le piastrine
  • Megacariocita maturo in fase di campeggiamento piastrinico: all’interno del citoplasma del megacariocita si formano dei canalicoli, da questi si separano dei grossi frammenti che poi a loro volta si divideranno in frammenti più piccoli