Piastratura delle repliche e test di fluttuazione

 

La Piastratura delle repliche è una tecnica usata molto frequentemente per mettere in evidenza dei batteri che possiedono delle particolari caratteristiche.

L’ALLESTIMENTO: ammettiamo di avere una brodo-coltura di Escherichia Coli estremamente sensibile alla streptomicina, dopo 24 ore di crescita si avranno circa 5 * 109 UFC / ml (quindi circa un miliardo di batteri). Prendiamo ora la piastra di coltura, che presenta un terreno in cui si permette lo sviluppo dei nostri Escherichia coli, come un terreno di agar McConkey, seminiamo ora 100 µl di questi batteri (quindi circa 5 * 108 batteri). Se tutta la crescita di questi batteri andrà a buon fine, il giorno successivo sulla piastra sarà presente una patina confluente che ricoprirà tutta la piastra. Proseguiamo nel nostro esperimento utilizzando un particolare strumento, una specie di tronco di cono su cui è stato posizionato un pezzo di velluto teso da una specie di anello di metallo (si viene a formare una sorta di tamburo). Si dovrà quindi direzionare la piastra, ovvero segnare con un pennarello un particolare punto, e ripetere la stessa cosa sul velluto. Presa la piastra, essa va capovolta e premuta sul velluto, in questo modo ogni fibra di velluto viene a contatto con ognuna delle colonie che sono rappresentate sulla patina microbica, quindi una percentuale non irrilevante di questa patina rimane sul velluto. Prepariamo ora una serie di piastre (ad esempio 5) con lo stesso terreno colturale di prima, addizionate a della streptomicina in concentrazioni inibenti (circa 128 µg / ml). Ora si orientano le piastre, cioè si vanno a premere sul troco di cono esattamente nella stessa posizione di prima, così si fa passare un po’ di patina microbica rimasta sul velluto in ognuna delle piastre in successione. Fatto questo non resta che incubare queste piastre a 37 gradi centigradi, aspettiamo 24 ore e vediamo il risultato (ricordiamo che si suppone che non ci siano delle mutazioni nella piastra iniziale). Prese fuori una alla volta queste piastre batteriche, si vedrà in tutte una disposizione simile delle colonie rispetto alla piastra iniziale. Se fosse presa in considerazione solo una piastra, per Lamarck quello che è successo sarebbe dovuto all’antibiotico, il quale avrebbe creato diverse colonie di mutanti, quindi per Lamarck sarebbe l’antibiotico, la variazione dell’ambiente a creare questo nuovo carattere che ha permesso la crescita delle colonie batteriche. Considerandole però complessivamente, se l’antibiotico fosse il responsabile dell’attivazione della mutazione, si avrebbero dei numeri diversi di colonie e in posizioni diverse, data l’impossibilità da un punto di vista probabilistico di avere cinque piastre con delle colonie tutte posizionate in punti corrispondenti tra di loro. Quello che si deve supporre dunque è che una mutazione spontanea che conferisce la resistenza alla streptomicina fosse avvenuta, per effetto del caso, nelle colonie della piastra primaria, e che poi sia stata trasmessa in quelle secondarie.

Si può confermare ulteriormente questo concetto, prendendo la prima piastra, sovrapponendola a quella iniziale e segnando con un pennarello sul coperchio i punti corrispondenti alla crescita delle colonie mutanti. Ora, tenendo solo l’unica piastra che non è mai venuta a contatto con l’antibiotico (non si può quindi attribuire all’antibiotico in questo caso la causa della formazione di queste colonie), si prenda ora un’altra piastra con all’interno della streptomicina. Dopo aver suddiviso quest’ultima in cinque settori, raccogliamo e facciamo cinque semine a partire da questi cinque punti. Dopo aver incubato la piastra con la streptomicina per 24 ore, saranno cresciuti cinque ceppi microbici provenienti dalla piastra che non è mai venuta a contatto con l’antibiotico, e tutti e cinque resistenti alla streptomicina, questo a dimostrazione che è sempre presente in una popolazione di qualsiasi tipo una mutazione che può essere però espressa solo se l’ambiente ne viene in soccorso. L’ambiente ha la funzione quindi di selezionare qualcosa che precedentemente esiste già, che solitamente è svantaggiato, ma che in assenza di una concorrenza diventa predominante.

Un secondo esperimento un po’ meno evidente è il TEST DI FLUTTUAZIONE: in questo caso si ha sempre una provetta con una brodo-coltura, che dopo 24 ore arriva a dare origine a 5 * 109 batteri per millilitro (ovvero UFC / ml). Prendiamo ora una beuta da un litro e inseriamoci 10 microlitri di questa brodo-coltura, verranno così utilizzati 107 batteri. Se questa quantità viene posta in 1000 ml, avremo 10000 batteri per millilitro, ovvero 104 UFC / ml. Teniamo in considerazione che una brodo-coltura che contiene queste quantità di batteri è ancora limpida se la si osserva controluce, comincia ad essere leggermente torbida quando ci sono tra le 104 e le 105 UFC / ml. Dopo averla incubata, dopo circa 3-4 ore i batteri cominciano a replicarsi, ma inizialmente vanno abbastanza lentamente, infatti esiste una cosiddetta fase di latenza (anche chiamata fase di lag), in cui i batteri devono adattarsi alle nuove condizioni in cui si vengono a trovare. Quindi in questa fase di produzione degli enzimi atti ad utilizzare i substrati presenti, la cellula aumenta solo di volume, ma non si divide. A questo punto si divide in 2 la brodo-coltura, ovvero 500 ml sono messi in un’altra beuta, mentre gli altri 500 ml sono divisi in provette da 10 ml (così in tutto ci saranno 50 provette). Il tutto deve essere incubato a 37 gradi centigradi per 24 ore, ci si aspetta infatti come sempre che le cellule raggiungano la concentrazione finale di circa 109 UFC / ml. Bisogna specificare che il batterio è un Escherichia coli, ovvero è un batterio sensibile alla streptomicina, infatti stiamo utilizzando questo batterio in modo tale da poterne mettere in evidenza eventuali mutazioni nei confronti di questo antibiotico. Una volta che si arriverà ad osservare una bella torbidità (passate le 24 ore), seminiamo a partire dalla beuta e dalle provette, una serie di piastre addizionate a della streptomicina, poi incubiamo le piastre sempre per 24 ore. Se controlliamo prima le piastre allestite a partire dalle provette, troveremo un numero di colonie “fluttuante”, ovvero alcune provette avranno molte colonie, mentre altre provette ne avranno poche. Nelle piastre allestite invece a partire dalla beuta si avrà un numero di colonie abbastanza uniforme, quindi da una parte si ha una crescita costante, mentre dall’altra si ha una crescita fluttuante.

Se fosse valido il concetto di Lamarck, si avrebbe dovuto avere sempre, in entrambi i casi, un andamento fluttuante o un andamento uniforme. La separazione infatti viene fatta quando la concentrazione dei batteri è ancora abbastanza bassa, quando l’evento mutazionale non con certezza si è verificato (sappiamo che ha una frequenza pari circa a 108 cellule). Dopo diamo origine a due popolazioni diverse, una è una popolazione unica, nell’altra ci sono invece 50 sottopopolazioni diverse. Ora se l’antibiotico fosse il responsabile delle mutazioni, farebbe ottenere lo stesso risultato in entrambi gli esperimenti, ovvero in tutte le popolazioni che abbiamo considerato.

Attorno agli anni 50 dello scorso secolo fu isolata una Shigella multi-resistente, in particolare alla streptomicina, alla tetraciclina ed ai sulfamidici, successivamente furono isolati anche dei ceppi batterici resistenti fino a 5 antibiotici. Se si immagina che un tasso mutazionale medio di un carattere sia attorno a 107-108, la probabilità che in una popolazione si possa avere una mutazione contemporanea per cinque caratteri sarebbe di 1035, una popolazione del genere sarebbe talmente grande da avere un diametro superiore a quello della Terra, perciò è impossibile che si verifichi in un laboratorio, allora è necessario spiegare questo fenomeno con un altro meccanismo. Nel 1975-76 vi fu un’epidemia di Salmonella wien (isolata per la prima volta a Vienna), andando ad osservare l’antibiogramma (una misura della sensibilità agli antibiotici dei batteri mediante la deposizione di dischetti sulla superficie di una piastra in cui sono presenti le nostre colonie batteriche), si notava la resistenza di questo ceppo batterico a più antibiotici contemporaneamente (questo strumento è molto importante perché rappresenta l’analisi finale di un’indagine microbiologica). In questo esperimento abbiamo seminato il batterio su una piastra, poi siamo andati a deporre i dischetti sulla superficie della piastra batterica, dal quale diffonde l’antibiotico, naturalmente se il batterio è sensibile all’antibiotico, in prossimità del dischetto si creerà un alone d’inibizione dove non saranno presenti i batteri, in particolare la misura del diametro dell’alone ci indica l’efficacia di un particolare antibiotico sul mio batterio analizzato. Quando si è fatto l’antibiogramma di questa Salmonella, questa aveva un alone di resistenza che veniva siglato AKTCSSuTp, ovvero un acronimo per indicare l’ampicillina, la kanamicina, la tetraciclina, il cloramfenicolo, la streptomicina, i sulfamidici ed il trimetoprim, cioè era resistente a tutti questi antibiotici con un unico plasmide (aveva tra l’altro un ulteriore plasmide che codificava per delle altre resistenze), era perciò una Salmonella particolarmente virulenta. Tutto ciò non si poteva attribuire all’acquisizione di una mutazione improvvisa, si cominciò infatti da qui a pensare che ci fossero dei meccanismi diversi che permettevano l’acquisizione graduale di geni codificanti per l’antibiotico-resistenza. Il primo trasferimento di resistenza multipla analizzato risale al 1959, tra una Shigella ed un Escherichia coli, da qui si è dedotto che ci sono tre gradini che portano all’acquisizione delle antibiotico-resistenze, i quali sono:

  • mutazione, che si acquisisce con una variazione di una base azotata, che porta la cellula ad acquisire una resistenza
  • selezione da parte dell’ambiente del batterio resistente, che lo fa emergere
  • ricombinazione genica, che garantisce la trasmissibilità del carattere che codifica per la resistenza

La resistenza a questo punto si diffonde, anche tra i batteri che sono lontani dal punto di vista tassonomico. Ricordiamoci che i geni di resistenza sono sempre esistiti, infatti gli antibiotici vengono prodotti anche dai batteri e dalle muffe stesse, quindi i batteri che producono questi antibiotici devono essere resistenti a loro volta alla loro stessa azione.