Esami per la talassemia

Ci sono degli esami del sangue fondamentali per la diagnosi della Talassemia Alfa e Beta.

La tabella sottostante mostra dei valori normali delle varie emoglobine normali (HbA, HbA2 e HbF) presenti nell’adulto e come variano a seconda dell’età.
Tabella, valori dell'emoglobinaServe come punto di riferimento: la HbF è molto elevata alla nascita e cala con il passare del tempo, mentre le altre aumentano. Col progredire dell’età le due Hb si invertono: sicuramente al di sopra dei due anni (ma anche prima) si ha l’assetto emoglobinico tipico dell’adulto sano con la HbF in tracce (meno del 1 %), la HbA è prevalente (due catene alfa e due catene beta, circa il 97 % e oltre) e la HbA2 (due catene alfa e due catene delta) è inferiore al 3 % nella norma.

L’ELETTROFORESI del Hb serve per rivelare e identificare le emoglobinopatie: ciò vale per tutte le alterazioni dell’Hb, non solo per le anemie microcitiche. Il principio dell’elettroforesi è basato sulla separazione delle proteine sulla base della loro carica elettrica. Le Hb, quindi, migrano a seconda del loro peso e della loro carica. Le catene amminoacidiche che protrudono all’esterno hanno una carica, ma se si modifica il pH, gruppi differenti di queste catene vengono soppressi elettricamente, per cui si modifica la carica globale della molecola.
Alcune Hb instabili e alcune con una alterata affinità per l’O2 non si evidenziano con questo metodo (per alcune varianti emoglobiniche si deve ricorrere a metodiche un po’ più complesse), ma la maggior parte delle emoglobine anomale conosciute sì. In ogni caso, si usa acetato di cellulosa: la standardizzazione prevede che l’elettroforesi venga fatta prima a pH basico (8,6) e poi a pH acido (6). Il pH acido serve per evidenziare certe emoglobine anomale che a pH alcalino non si riescono a distinguere bene tra loro. L’aggiunta di urea 6 M e 2-mercaptoetanolo al tampone, sia a pH acido che basico, causa la dissociazione delle catene alfa e beta, che quindi migrano indipendentemente e si riesce a vedere su quale catena è presente l’anomalia.

 

DIAGNOSI DI ALFA E BETA – TALASSEMIA

Per la diagnosi di beta – talassemia, che è la forma più frequente delle nostre zone, il primo livello è il dosaggio quantitativo dell’HbA, ma soprattutto dell’HbA2, che si esegue su una colonna cromatografica. È più semplice e meno costoso dell’elettroforesi. Si tratta del primo screening che viene fatto per mettere in evidenza un eventuale aumento dell’HbA2, tipico della beta – talassemia, nella quale invece cala l’HbA1 (per il difetto di sintesi delle catene beta). Normalmente, nell’adulto, l’HbF è inferiore al 1 %. Una volta l’HbF si studiava con metodi abbastanza complicati come il Test della denaturazione alcalina (sfrutta la resistenza alla denaturazione da parte dell’idrossido di Na), oppure il Test della resistenza agli acidi (Test di Kleihauer). Adesso l’HbF si può documentare anche con anticorpi monoclonali diretti contro l’HbF oppure nello screening dell’elettroforesi, come per le altre Hb.

La metodica che in generale si utilizza maggiormente oggi è la HPLC (high performance liquid cromatography – “cromatografia liquida ad alta efficienza/risoluzione”). A differenza dell’elettroforesi dell’Hb questa tecnica mette in evidenza delle alterazioni che un tempo richiedevano degli accertamenti più approfonditi. Questa tecnica è nata appunto come metodica per mettere in evidenza alcune Hb anomale: nel corso del tempo è stata perfezionata e sono state apportate delle variazioni tecniche particolari (ad esempio sono state allungate le colonne) per cui, a detta degli esecutori, si riesce ad avere una buona “geografia” di moltissime alterazioni dell’Hb. Utilizza una pressione elevata per forzare il solvente (fase mobile) attraverso colonne impaccate contenenti particelle molto fini, che danno separazioni ad alta risoluzione.

Più problematica risulta essere la diagnosi dell’alfa – talassemia, in cui si ha un difetto di produzione di catene globiniche alfa. Mentre nella beta – talassemia tutto si gioca sulla valutazione dell’incremento dell’HbA2, nell’alfa talassemia nella maggior parte dei casi l’elettroforesi è normale, quindi il dosaggio cromatografico non serve a nulla. In alcuni casi, in realtà, con l’elettroforesi fatta migrare in ambiente alcalino (elettroforesi alcalina) si riescono a mettere in evidenza l’Hb Bart’s (che si ha nella forma più grave di alfa – talassemia, responsabile dell’idrope fetale e quindi incompatibile con la vita – comporta la totale mancanza di catene alfa, mentre ci sono solo catene gama) e l’HbH (è la variante omotetramerica con solo catene beta). Per le altre varianti si ricorre a metodiche molto più complesse come lo studio della biosintesi delle catene globiniche in vitro o lo studio del mappaggio dei geni alfa con metodiche di biologia molecolare, molto complesse. Questo studio di terzo livello non è presente in tutti i laboratori: per esempio a Modena, nel laboratorio del Policlinico, c’è una buona diagnostica soprattutto con la HPLC. Nell’ambito delle emoglobinopatie, invece, il centro più all’avanguardia in Emilia Romagna si trova a Ferrara, la zona in cui si ha anche la maggior concentrazione di casi di beta talassemia.

Nel sospetto di alfa – talassemia vi è un’anemia microcitica in cui l’assetto del ferro è normale, però l’HbA2 è correttamente ridotta. Un’anemia microcitica è ferro-carenziale oppure è una talassemia, e se non è una beta – talassemia è per forza un’alfa – talassemia.

 

LIVELLI DI DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE EMOGLOBINOPATIE

  • 1° livello (screening): esame strumentale e morfologico del fenotipo ematologico, al fine di escludere che si tratti di un quadro ferro-carenziale. Poi si può fare la separazione qualitativa delle frazioni emoglobiniche, la determinazione quantitativa dell’HbA2, anche col vecchio metodo. In sostanza si tratta di determinare se si tratta di una beta talassemia, che è l’emoglobinopatia più frequente dalle nostre parti
  • 2° livello: se lo screening non porta risultati, si esegue un’analisi più approfondita attraverso la sintesi in vitro delle catene globiniche e la ricerca delle mutazioni dei geni globinici con la genetica molecolare (possono essere presenti diversi difetti molecolari che danno lo stesso fenotipo)
  • 3° livello: sequenziamento dei geni globinici e delle catene globiniche