DNA e RNA nella diagnosi in microbiologia

È l’amplificazione molecolare di un acido nucleico, che può essere DNA o RNA.
Si ricorre alla diagnostica molecolare quando ci sono delle difficoltà con la diagnostica convenzionale o quando serve una diagnosi in tempi rapidi. Tutte le volte che il microrganismo fatica a crescere in vitro il microbiologo ricorre alla diagnostica molecolare, ad esempio il HCV non cresce in vitro, quindi la diagnostica si può fare solo con la diagnosi molecolare, l’agglutinazione ed il test ELISA. Quando si parla di diagnostica molecolare si intendono essenzialmente la PCR e il Southern blotting, metodiche che permettono il riconoscimento di una sequenza genica specifica di quel particolare microrganismo in un certo campione biologico.

Esistono due categorie fondamentali di test diagnostici molecolari:

  1. TEST di IBRIDIZZAZIONE, che si avvalgono dell’utilizzo di sonde, in pratica si pone direttamente del DNA marcato in un campione biologico. La sonda è qualcosa che si sa a priori essere complementare al DNA dell’organismo che si sospetta sia presente in quel campione biologico. Il DNA è di solito marcato con fluorocromi o luminoli
  2. TEST di AMPLIFICAZIONE, come la PCR, che significa ottenere da una o poche molecole milioni di molecole

 

Ibridizzazione (od ibridazione) dell’acido nucleico

Si pone direttamente una sonda nel campione biologico. Le sonde possono essere marcate in due modi:

  • radioattivo (soprattutto nei vecchi sistemi)
  • non radioattivo, ci sono per esempio il sistema in fluorescenza od il sistema in chemioluminescenza (luminometro)

Il vantaggio di lavorare con le sonde è che i tempi sono molto rapidi, d’altra parte il grosso limite è che se di quel DNA da ricercare non ce n’è abbastanza, si rischia di non vedere niente: la sensibilità di questi saggi è quindi abbastanza bassa e in alcuni casi inadeguata.
Le principali tecniche di ibridazione sono DOT BLOT, SLOT BLOT e SOUTHERN BLOT. Sono sistemi diversi che danno lo stesso risultato, cioè consentono di dimostrare se è avvenuta o meno l’ibridazione tra una sonda marcata e il campione biologico in cui si sospetta la presenza di un microrganismo. L’acido nucleico viene prima separato per elettroforesi, poi viene blottato su una membrana di nylon e successivamente viene ibridizzato.

Nel Southern blot si fa un’elettroforesi, quindi una separazione in base alle dimensioni, e la sonda si lega dove trova complementarietà, in questo modo si può capire quali sono le dimensioni della banda che ha concesso l’ibridazione. È un sistema lungo e laborioso che viene fatto nei laboratori di riferimento.

Nello Slot blot o nel Dot blot (sono praticamente la stessa cosa, cambiano piccoli dettagli) non si fa correre l’acido nucleico, ma quello che è l’estratto del campione biologico (si utilizza una soluzione litizzante per ottenere il DNA) viene spinto direttamente da un sistema a vuoto sulla membrana. Qui non c’è una corsa elettroforetica che divide le bande in base alle loro dimensioni, ma tutto ciò che è stato estratto dal campione viene schiacciato contro il filtro ottenendo un bottoncino, uno spot, e poi covalentemente viene legato da un sistema di blottaggio particolare. Sullo spot si mette la sonda. Il vantaggio è la sua rapidità, il limite è che si vede un segnale ma non si conosce chi ha concesso l’ibridazione, anche perché si possono testare più campioni contemporaneamente. Quindi, il Dot blot, rispetto al Southern blot, è un sistema molto più rapido, ma più grossolano, dà un’idea orientativa della positività e della negatività al test.

L’ibridazione con le sonde è molto vantaggiosa quando si lavora sui tessuti, perchè si può deporre su una “fettina” di tessuto bioptico delle sonde di DNA e ricercare poi al suo interno il segnale radioattivo, colorato o fluorescente. Si parla in questo caso di IBRIDAZIONE IN SITU. Il limite è che con una bassa positività si vede poco, ma c’è l’enorme vantaggio di stabilire esattamente in quali distretti si è localizzato il microrganismo se è presente una positività. Inoltre è possibile associare la presenza del microrganismo ad un quadro istopatologico.

 

PCR

Consente di amplificare:

  • l’acido nucleico che si sospetta essere presente in un campione biologico
  • la sonda
  • il segnale emanato dalla sonda

Questo test di amplificazione ha una sensibilità altissima, si possono ottenere dei dati positivi anche quando si hanno poche molecole dell’acido nucleico nel campione biologico. Purtroppo ha anche dei limiti, come ad esempio un alto rischio di contaminazione, di cross-reattività, di falsi negativi, … .
Fare una PCR significa estrarre il DNA da un certo campione biologico, denaturarlo alzando la temperatura in modo che il DNA a doppio filamento diventi a singolo filamento, poi a questo estratto si aggiungono dei primer, dei nucleotidi e una polimerasi. A questo punto, se il primer si attacca perché ha trovato la sequenza che gli è omologa, si costruiranno delle copie di DNA. Dal primo ciclo si ottengono, da due catene di partenza, quattro catene di DNA, dal secondo ciclo se ne ottengono otto, dal terzo se ne ottengono sedici, e così via. Con n giri di PCR si ottengono 2n filamenti di DNA. In questo modo si amplifica la molecola in modo da poterla sequenziare ed identificare.

  • Amplificazione del target. È la PCR convenzionale. Si parte da una sequenza che si pensa sia presente nel campione biologico, poi su questa sequenza si disegnano dei primers disposti in orientamento opposto (un primer 3’ e un primer 5’) che, se trovano la sequenza complementare, andranno a legarsi nel DNA che prima è stato denaturato, per aprirlo e renderlo a singola catena. Da questa unica molecola se ne ottengono due, poi quattro, poi otto, poi esponenzialmente si arriva a milioni di copie, proprio perché nel campione ci sono abbondanza di primer, nucleotidi ed enzimi (ad esempio la polimerasi, una molecola che deve garantire l’accoppiamento dell’acido nucleico rispetto al primer che fa da sistema di avvio).
  • Amplificazione della sonda: LCR (ligase chain reaction). Viene sfruttato un sistema presente nei virus per cui, con una ligasi, si crea un amplificato della sonda stessa.
  • Amplificazione del segnale che la sonda emana, attraverso quello che si chiama Dna pettine o branched DNA. Il segnale viene moltiplicato centinaia di volte, per cui alla fine si arriva ad identificare una specie microbica in un sistema biologico.

Nested PCR

È molto utilizzata in virologia. È la PCR nel prodotto di PCR (cioè in un acido nucleico già amplificato): si tratta di una doppia amplificazione che viene condotta con due set di primers. Nella prima PCR ci sono due primers che legano tutte le sequenze relative a un certo gruppo di batteri (o virus): i primers, che sono molto generici, riconoscono una sequenza di Dna che è genere-specifico o anche classe-specifico, e amplificano tutto quello che c’è di batterico in un campione biologico. Questo primo amplificato, che chiamiamo “amplificato della prima serie di primer”, viene successivamente sottoposto a un’altra reazione di PCR, ad un’altra coppia di primers che sono specie-specifici e capaci di legarsi internamente al frammento che è stato amplificato la prima volta. Si chiama Nested PCR per dire che si ha una reazione dentro un’altra reazione: il primo amplificato sarà 250 basi, mentre il secondo amplificato sarà di 130 basi, perché la seconda coppia di primers specie-specifici riconoscono solo quel microrganismo, si inseriscono nel primo amplificato dove trovano la complementarietà. Il sistema è molto efficace e sensibile.

Microarrays

Sono dei microsistemi, dei chip, cioè un supporto dove sono spottate, ad opera di un robot, centinaia o migliaia di molecole secondo un certo schema. Possono essere molecole di DNA o proteine. È una diagnostica di nuova generazione dove tutto è miniaturizzato, all’interno di uno stesso chip ci sono centinaia o migliaia di molecole che possono essere tutte simultaneamente screenate contro il campione biologico di un individuo. Il vantaggio è enorme, perché si possono fare delle valutazioni multiparametriche, utilizzando volumi minimi e con costi e tempi molto ridotti.