Coltura cellulare e batterica nella diagnosi microbiologica

Sulla base delle indicazioni ottenute dal microscopio e/o dai test rapidi si fa l’esame colturale, che significa mettere il microrganismo in condizioni favorevoli affinchè si moltiplichi, in modo da poterlo poi isolare ed identificare.
Attraverso questa amplificazione biologica da 1000-5000 batteri presenti in un campione biologico riusciamo ad ottenerne milioni. Si procede quindi in due fasi:

  1. Isolamento (richiede 1/2 giorni)
  2. Identificazione (richiede 1/2 giorni)

 


ISOLAMENTO significa che da un liquor o un tampone faringeo si possono avere delle colonie isolate, degli spots indipendenti e ogni spot è un clone, una popolazione microbica diversa da un’altra. Questo si ottiene strisciando su un terreno di coltura, che nella maggior parte dei casi è solido, dei microrganismi. I terreni di coltura devono essere appropriati, possono essere selettivi o differenziali, in modo che crescano solo alcuni microrganismi.
In alcuni casi si è costretti ad utilizzare dei terreni liquidi, cioè si semina per immersione il microrganismo e si ottiene un intorpidimento, che ne testimonia la crescita. Saranno necessarie delle subculture su un terreno solido per arrivare alla singola colonia.
Le singole colonie in alcuni casi consentono già di fare una diagnosi se ci sono dei terreni molto selettivi.
Per esempio, si possono avere degli aloni di emolisi che aiutano distinguere lo Streptococco beta-emolitico, che produce delle tossine emolitiche particolarmente efficaci.

 

In molti casi però l’isolamento non è sufficiente e bisogna passare alla fase di IDENTIFICAZIONE. Gli organismi isolati subiscono ulteriori modificazioni ed ulteriori analisi per arrivare al referto definitivo. Si considerano quindi:

  • La morfologia delle colonie
  • Colonie rotonde e margini netti = cocchi
  • Colonie R (rugose) – S (lisce) = acapsulati – capsulati
  • Colonie sciamanti
  • Colonie mucose
  • Le caratteristiche microscopiche delle cellule della colonia
  • I caratteri biochimici delle colonie (se fermentano e come fermentano, se acidificano o se producono enzimi particolari)
  • I caratteri antigenici delle colonie, sempre attraverso l’agglutinazione od il test ELISA
  • Antibiogramma
  • Il potere patogeno in modelli sperimentali

 

Ci sono dei sistemi che permettono di valutare il PROFILO BIOCHIMICO di una specie microbica, come il sistema Vitek. Si utilizzano delle “card”, sistemi grandi come una carta di credito in cui sono presenti decine di pozzetti tutti collegati ad un unico foro iniziale e in ciascun pozzetto è contenuto un terreno disidratato con un certo tipo di substrato. Queste schede vengono insementate con il microrganismo preso dalla colonia isolata e poi vengono messe in incubazione in una macchina (Vitek). A distanza di poche ore il microsistema dirà se sono avvenute opacizzazioni, quindi delle crescite, o se ci sono stati cambiamenti di colore, quindi acidificazioni o fermentazioni. Ogni batterio ha un pannello di reazioni caratteristiche, diverse da specie a specie. Al microscopio i batteri come l’Escherichia coli e la Salmonella sono tutti uguali: gram-, allungati e mobili. Invece attraverso questi sistemi che verificano i loro metabolismi si possono distinguere e fare una diagnosi precisa.

 

È possibile inoltre fare una VERIFICA DEGLI ANTIGENI PRESENTI su un certo isolato clinico per identificare il microrganismo, attraverso il saggio di agglutinazione o il test ELISA.

 

L’ANTIBIOGRAMMA è un test di sensibilità agli antibiotici in vitro, che permette di valutare quali sono ancora efficaci e quali no nei confronti di un certo microrganismo. Si possono fare:

  • Test di diffusione in agar o di Kirby-Bauer
  • Test dell’epsilometro (E-test)
  • Test di diluizione in brodo

Il test di Kirby-Bauer prevede la coltura di un microrganismo in modo omogeneo su un terreno appropriato (terreno di Kirby-Bauer), in cui il microrganismo cresce rendendone opaca la superfice. Su questo terreno si pongono dei dischetti imbevuti di farmaci e il giorno dopo si valuta se intorno al dischetto si sono creati degli aloni di inibizione. Andando a misurare gli aloni di inibizione e facendo il raffronto con le tabelle di riferimento si può dire se e quanto quel microrganismo è resistente all’antibiotico.

L’E-test è più sofisticato perché utilizza delle strisce in cui l’antibiotico è stato legato in modo covalente secondo un gradiente di concentrazione. Fornisce un risultato “a goccia”, che indica anche qual è la dose minima per inibire la crescita del microrganismo.

Il metodo della micro-diluizione in brodo è abbastanza semplice ma ha tempi lunghi. Si mettono diluizioni scalari dello stesso antibiotico su tanti tubi (la concentrazione è in µg/ml a decrescere in ragione di due), poi vengono tutti insementati con la stessa quantità di batteri che sono stati già isolati e riconosciuti e poi si aspetta 24 ore. Dopo 24 ore si va a vedere quali tubi si sono opacizzati (il segno di crescita dei batteri) e quali no, a occhio o attraverso uno spettro fotometro. Nell’esempio, 1 µg/ml rappresenta la minima concentrazione inibente (MIC), cioè la minima concentrazione di un antibiotico che permette la completa inibizione della crescita batterica in determinate condizioni. La concentrazione minima battericida (MBC) si ottiene a distanza di due giorni, facendo delle subculture su terreni solidi senza antibiotico da quei tubi dove non c’è stata la crescita. Si attendono altre 24 ore e poi si va a vedere se ci sono le colonie oppure no.

 

In alcuni casi si può fare anche la valutazione del POTERE PATOGENO, in vivo oppure in vitro, del microrganismo che abbiamo già identificato e di cui abbiamo già fatto l’antibiogramma. Si possono valutare dei parametri nel tempo che indicano il grado di virulenza di quel ceppo microbico. In genere si fa nei centri di riferimento o dai gruppi di ricerca. È preziosa perché aggiorna su come si realizza il rapporto ospite-parassita. In vitro si possono ricercare gli effetti citopatici, mentre in vivo si valutano le risposte dell’animale.

 

Attraverso tutto il percorso descritto finora, che dura qualche giorno, si arriva a fare la diagnosi microbiologica definendo la specie od addirittura lo stipite od il ceppo del microbo.