Coltura batterica su piastra di Petri

I terreni di coltura presentano una composizione in nutrienti tale da soddisfare la crescita della maggior parte dei microrganismi di uno specifico gruppo (batteri, lieviti e muffe).

– TSB (Tryptic Soy broth)

– TSA (Tryptic Soy agar)

– PCA (Plate count agar)

Quando vengono allestite certe indagini microbiologiche bisogna seguire certe norme ISO/UNI, che riferiscono quali sono i terreni che si usano, le modalità di semina, di incubazione e diverse altre cose, ad esempio per le analisi dell’acqua viene utilizzato il PCA per la determinazione della carica microbica totale dell’acqua.

Queste due immagini si riferiscono a delle semine per inclusione in PCA per determinare la carica batterica di un campione (potrebbe essere urina, acqua, latte o qualsiasi altra cosa). Ci sono dei numeri in blu (27 e 91) che corrispondono al numero di colonie contate, segnando con un pennarello ciascuna colonia, evitando di contare due volte la stessa colonia. Si prende la piastra di Petri vuota e sterile, si vuotano circa 20 ml di agar ancora liquido (ad una temperatura maggiore di 45° C), si omogeneizza ed i batteri rimangono bloccati in quel punto, si moltiplicano nel giro di circa 18 ore e formano una colonia visibile ad occhio nudo.

I TERRENI ARRICCHITI

Nei terreni arricchiti andiamo a cambiare la “ricetta” del terreno d’uso generale aggiungendo alcune sostanze come il sangue, il siero, il liquido ascitico, le vitamine e gli amminoacidi. Il siero, oltre ad essere una sostanza molto ricca dal punto di vista metabolico, contiene l’albumina che è in grado di purificare il terreno dai metalli pesanti e dalle sostanze che possono essere tossiche e ostacolerebbero lo sviluppo dei batteri. Questi terreni servono per far sviluppare dei batteri molto esigenti e non vengono quindi usati per i batteri ambientali o saprofiti, che si sviluppano dappertutto.

 

L’AGAR SANGUE

È un terreno arricchito con il sangue. Si ottiene partendo da un terreno che in quel momento è liquido, come ad esempio un TSA messo a bagnomaria prima a 100° C e poi a 50° C, aggiungendovi un 5 % di sangue (i globuli rossi di solito sono di coniglio, pecora o montone, tra i quali dal punto di vista metabolico non c’è una grande differenza per un batterio).

Ci sono dei microrganismi che danno dei suggerimenti sulla loro identità quando crescono in agar-sangue, quindi questo terreno non è solo un terreno nutrizionale, ma anche un terreno indicatore.

Nell’immagine sono stati seminati tre streptococchi diversi, lo streptococco è un batterio esigente e richiede un terreno arricchito, in questo caso si usa l’agar-sangue perché permette di osservare anche il comportamento emolitico del ceppo microbico sulla base del quale gli streptococchi si classificano in:

  • α-emolitici: sono anche detti viridanti perché aggrediscono solo parzialmente i globuli rossi, trasformandoli in qualcosa di simile alla metaemoglobina, quindi le colonie si circondano di un alone torbido e verdognolo. Il più importante tra questi è lo Streptococcus pneumoniae, che è spesso residente nelle prime vie aeree.
  • β-emolitici: si definisce β-emolitico un batterio che aggredisce completamente il substrato dei globuli rossi, metabolizzando completamente l’emoglobina, formando attorno alla colonia un alone completo di emolisi trasparente, dove scompaiono completamente tutti i globuli rossi, e posso vedere la parte opposta della piastra. Fa parte di questo gruppo lo Streptococcus pyogenes, che è lo streptococco patogeno per eccellenza corresponsabile inizialmente di patologie banali come il mal di gola, l’angina streptococcica o la tonsillite, ma poi anche di patologie più gravi, da quelle suppurative, la scarlattina, l’erisipela e la febbre puerperale, alle malattie autoimmunitarie come la glomerulonefrite, l’endocardite od il reumatismo articolare acuto. È anche definito streptococco β-emolitico di gruppo A, per le seguenti caratteristiche:
  • Streptococco = è un batterio Gram+ a forma di cocco che si dispone a catenella
  • Gruppo A = sulla base del polisaccaride esterno del batterio

Alcuni soggetti potrebbero essere portatori sia dello Streptococcus pneumoniae che dello Streptococcus pyogenes, entrambi residenti nelle vie aeree superiori, perciò si ricorre alla semina in agar-sangue per distinguere i due batteri a seconda dell’emolisi che danno: l’α-emolisi completa o la β-emolisi parziale. Un’altra caratteristica per differenziarli è la sensibilità a particolari antibiotici: lo Streptococcus pyogenes è sensibile alla bacitracina, lo Streptococcus pneumoniae è invece sensibile all’optochina. Queste sostanze sono messe su dei dischetti appositi che vengono posizionati sulle piastre per andare a vedere se danno un’inibizione sulla crescita del batterio.

  • γ-emolitici: non sono emolitici e gli streptococchi non emolitici di solito non sono neanche patogeni. Non si apprezza nessun tipo di emolisi attorno alla semina di questi batteri.

L’agar sangue è utilizzato anche per coltivare le Neisserie, che richiedono un terreno arricchito.

AGAR SANGUE COTTO (AGAR CIOCCOLATO)

Il sangue viene posizionato a 60° C per mezz’ora e assume il colore della nutella, poi viene aggiunto sempre al 5 % in un terreno in quel momento liquido, come abbiamo visto prima. In questo caso il sangue viene cotto perché normalmente contiene delle sostanze antibatteriche aspecifiche che possono impedire lo sviluppo dei batteri più delicati, come le Neisserie gonorrhoeae e le Neisserie meningitidis, che non si coltivano in agar-sangue, ma in agar-cioccolato.

I TERRENI SELETTIVI                                                                                                                                        

Ci aiutano ancora di più ad arrivare ad isolare un batterio da un campione con una flora polimicrobica.

Oltre ai normali componenti nutritivi, contengono delle sostanze chimiche che esercitano un’azione inibente nei confronti di alcuni microrganismi o gruppi di microrganismi, senza interferire, nelle dosi di utilizzo, con l’organismo da isolare. Se ci sono anche degli indicatori che ci danno delle informazioni su quello che è il batterio, essi sono detti selettivi differenziali.

  • PALCAM à LISTERIA

Un esempio di terreno selettivo è il PALCAM, indicato per l’isolamento della Listeria, che cresce su questo terreno, circondandosi di un alone nero. La selettività è dovuta alla presenza nel terreno di:

  • litio cloruro
  • polimixina B (è un antibiotico che funziona come un disinfettante cationico, che agisce sulle membrane solubilizzando i fosfolipidi, evidentemente non agisce sulle Listerie)
  • ceftazidime (è una cefalosporina di terza o quarta generazione) ed acriflavina, che permettono lo

sviluppo della Listeria e non di altri batteri

Il PALCAM sfrutta due indicatori: l’idrolisi dell’esculina e la fermentazione del mannitolo. Infatti la Listeria idrolizza l’esculina e non fermenta il mannitolo, infatti produce delle colonie circondate da un alone nero o scuro. I contaminanti più comuni, come gli stafilococchi e gli streptococchi, fermentano il mannitolo, causano il viraggio dell’indicatore e crescono con delle colonie circondate da un alone giallo. Andando ad osservare le colonie scure di Listeria ci si rende conto che queste sono ombelicate, cioè presentano un’invaginazione centrale nella colonia dovuta all’autolisi dei batteri che in quel punto muoiono. Il PALCAM è un terreno molto impiegato per la messa in evidenza della Listeria monocytogenes, un patogeno importantissimo se si pensa che il 30 % dei casi di listeriosi è mortale.

  • ACQUA PEPTONATA ALCALINA à VIBRIONE DEL COLERA

Non è altro che dell’acqua in cui aggiungiamo un po’ di proteine, un po’ di peptoni e portiamo il tutto a pH = 10. È un terreno selettivo in cui cresce solo il vibrione del colera, che non è per niente esigente e resiste bene ai pH alcalini.

  • BRODO SELENITE à SALMONELLE e le SHIGELLE

Serve ad avvantaggiare lo sviluppo di Salmonelle e Shigelle rispetto agli altri batteri. È utilizzato per l’arricchimento di Salmonelle e Shigelle in un campione, ad esempio di feci. Quando un soggetto ha una patologia gastrointestinale si fa una coprocoltura, ovvero si fa una prima semina sui terreni selettivi ed a parte si mette un piccolo campione di feci in una provetta con una brodo selenite. Se non cresce niente al primo isolamento, il giorno dopo si andrà a fare una seconda semina prelevando il materiale dalla provetta con la brodo selenite, nel quale se la salmonella è presente sarà stata selezionata ed avvantaggiata nel suo sviluppo rispetto agli altri batteri, e sarà rappresentata in quantità superiore rispetto alla prima semina, dove la carica microbica era troppo bassa per far sviluppare le colonie. Ottengo così un arricchimento che mi permette di osservare la presenza di Salmonelle nella seconda semina, che si fa dopo 24 ore, anche se queste erano poco rappresentate nel campione iniziale, perché vengono selezionate, sono infatti avvantaggiate dallo sviluppo in questo terreno selettivo ed aumentano in quantità.

  • AGAR MacCONKEY à GRAM-

Permette lo sviluppo solo dei batteri Gram negativi sulla base della seguente differenza tra i batteri Gram positivi e i batteri Gram negativi: nei batteri Gram- avevamo la membrana esterna che andava a formare lo spazio periplasmico, ovvero l’intercapedine tra le due membrane, quella citoplasmatica e la membrana esterna, mentre all’interno c’era poi un sottile strato di peptidoglicano, invece nei batteri Gram+ c’era solo questo grosso polimero di peptidoglicano che veniva a contatto immediatamente con la membrana citoplasmatica. Inoltre i batteri Gram+ sono molto sensibili agli effetti dei sali biliari, delle molecole idrofobiche che riescono a penetrare attraverso il peptidoglicano andando a ledere la membrana nei batteri Gram+, mentre nei batteri Gram- rimangono all’esterno per la presenza di questa membrana esterna atipica che ne impedisce l’entrata. Quindi addizionando un terreno di sali biliari, otteniamo un terreno selettivo esclusivamente per i batteri Gram-, perché non cresceranno i batteri Gram+. Un terreno così congeniato è detto terreno di MacConkey.

L’agar MacConkey è poi addizionato ad un indicatore di pH, di solito il rosso neutro, e del lattosio che permette di discriminare, tra i patogeni intestinali, i fermentanti e non fermentanti il lattosio: tra i patogeni non fermentanti il lattosio che fanno parte della famiglia delle Enterobacteriaceae sono compresi la Shigella e la Salmonella. Se si appalesano dei batteri fermentanti il lattosio con una colonia rosso-bordeaux vuol dire che non ho né delle Shigelle né delle Salmonelle. Se invece ottengo delle colonie di altri colori si tratterà di batteri fermentanti il lattosio, ma per capire se sono Shigelle,Salmonelle o anche dei Proteus dovrò procedere ad analisi più specifiche o andando a cercare gli antigeni specifici con degli anticorpi specifici con un’agglutinazione diretta sul vetrino, oppure indagando la presenza di alcuni caratteri metabolici specifici come la fermentazione di altri zuccheri oltre al lattosio, in particolare questo si fa con dei sistemi rapidi che si chiamano enterotube [l’enterotube è un tubo di plastica, diviso in 12 cellette, ognuna riempita con una specifica combinazione terreno – reagente – indicatore che permette di classificare i batteri enterici in base al loro metabolismo: ne esistono di diversi tipi, ognuna adatta ad una particolare classificazione. Un ago mette in comunicazione le 12 cellette e permette l’inoculo dei batteri. Due tappi alle estremità proteggono l’impugnatura e lo spillo dell’ago di inoculo. Nel momento dell’inoculo si rimuovono i tappi e si preleva con l’ago una colonia, il più circolare possibile per essere sicuri di inoculare un solo ceppo batterico, quindi si tira l’ago fino in fondo e senza sfilarlo, facendolo girare. Si reinserisce l’ago nelle stesse modalità fino a raggiungere la tacca segnata sull’ago, a questo punto si spezza l’impugnatura in corrispondenza del segno. L’impugnatura spezzata viene sterilizzata su un bunsen, quindi la si usa per forare le prime 8 cellette che richiedono un ambiente aerobio. L’incubazione avviene per 24 ore a 37° C, in verticale, con la parte aerobica verso l’alto. Terminata l’incubazione si procede alla lettura ed all’interpretazione dei risultati. Insieme ad una enterotube inoculata se ne incuba anche una non inoculata come riferimento].

  • MANNITOL-SALT-AGAR (TERRENO DI CHAPMAN O TERRENO ALLA MANNITE) à GRAM+

Permette lo sviluppo dei batteri Gram+ perché gli avvantaggia a scapito dei batteri Gram negativi. Alla solita ricetta di base è aggiunta la sostanza che serve a far identificare il batterio, in questo caso abbiamo di nuovo un indicatore di pH che è il rosso fenolo, abbiamo uno zucchero che serve a valutarne l’avvenuta fermentazione ad opera del batterio e che è appunto la mannite, e la sostanza selettiva che impedisce lo sviluppo dei batteri Gram-, che è il NaCl (allo 7,8 %), che rende il terreno particolarmente ipertonico con una concentrazione molto elevata di sali, che fa sviluppare esclusivamente i batteri che hanno una certa tendenza ad essere alofili, tra i quali appunto i batteri Gram+, e tra i batteri Gram+ soprattutto gli stafilococchi ed i micrococchi, che sono i più alofili. Questi batteri crescono bene in un ambiente ipertonico senza farsi disidratare, come avviene invece ai batteri Gram- che perciò non crescono in questo terreno. Questo terreno mi permette di discriminare tra i batteri Gram+ che fermentano o meno la mannite: la fermentazione di questo zucchero comporta una diminuzione del pH (al di sotto di 6-7) che si appalesa con una variazione del colore dell’indicatore ed il terreno da rosso che era, diventa giallo.