Colorazione di Gram

GRAM Hans Christian Joachim, biologo danese, ha dato il nome alla colorazione che serve ad identificare i batteri in Gram+ o Gram-. Come tutte le scoperte essa è stata fatta inconsapevolmente, in particolare Christian Gram faceva le autopsie e voleva discriminare nelle cellule la presenza dei cromosomi, proprio perché nei batteri essi non erano presenti. Quello che alla fine trovò fu invece una serie di colorazioni diverse, in particolare una metteva in risalto delle differenze specifiche tra i batteri stessi, quindi prima di scoprire la composizione dei batteri, venne trovato un modo per distinguere due classi particolari di batteri, attraverso la colorazione di Gram. La colorazione viene usata sempre in campo microscopico, a meno di non volere osservare lo specifico batterio con un ingrandimento almeno pari a 400X, sapendo già che tipo di batterio stiamo andando ad analizzare. Per questo tipo di colorazione vengono usati due coloranti, che vengono allestiti in 5 minuti. Si prepara innanzitutto il materiale patologico, poi si stempera la patina microbica su un vetrino portaoggetti dove è stata posizionata una goccia di soluzione fisiologica. Si spalma la patina sul vetrino e lo si fa asciugare, poi si passa due o tre volte la piastrina sulla fiamma in maniera rapida, tenendola in mano, così da accorgersi della quantità di calore che viene utilizzato sul nostro vetrino. Il primo colorante che si usa è il violetto di genziana, in particolare lo si lascia 1,5 minuti a contatto con il vetrino, in particolare questo è un colorante idrofilo, quindi nei batteri Gram+ entra e passa all’interno del peptidoglicano, anche perché non crea nessun danno alla membrana citoplasmatica, mentre nei batteri Gram- farà fatica a entrare all’interno a causa della presenza della membrana esterna. Si aggiunge poi per 1,5 minuti il liquido di Lugol, una soluzione di iodio e ioduro di potassio in acqua, che non è un colorante, ed essendo idrofilo riesce a penetrare la cellula nella stessa maniera con cui abbiamo visto agiva il violetto di genziana. Quando il liquido di Lugol ed il violetto di genziana si trovano all’interno di una cellula, si combinano e formano un composto idrofobico che non riesce ad essere estratto, rimane incastrato all’interno, anche se si usano dei decoloranti come l’alcol o l’acetone, in quanto non riescono più facilmente a passare attraverso la parete batterica dei batteri Gram+, che è molto resistente al passaggio delle sostanze idrofobiche.

Poi si aggiunge il decolorante (l’alcol) per 30-40 secondi, ed è un momento importante, perché se si lascia il decolorante per troppo tempo, anche i batteri Gram+ possono perdere il loro colorante. Si continua poi la colorazione eliminando l’alcol con l’acqua. Si aggiunge il colorante di contrasto che è la fucsina diluita, per circa 1 minuto, poi si lava il vetrino da questo colorante e si asciuga il tutto con della carta assorbente. Ora possiamo porre il vetrino sotto al microscopio, ad un ingrandimento circa pari a 1000 (100 di obiettivo e 10 di oculare), previa l’aggiunta di una goccia d’olio da immersione, perché l’osservazione viene fatta immergendo l’obiettivo all’interno della goccia d’olio, per impedire che dell’aria venga ad interporsi tra l’obiettivo ed il vetrino, altrimenti i raggi che vanno dal condensatore all’oculare verrebbero rifratti rendendo l’indice d’ingrandimento più basso (l’olio ha lo stesso indice di rifrazione del vetro, che è più alto di quello dell’aria). I batteri Gram+ sono i batteri che rimangono viola, e non perdono il colore, mentre i batteri Gram- perdono il colore o addirittura non lo assorbono neanche, si trovano infatti colorati con il colorante di contrasto perché una volta utilizzato l’acetone o l’alcol, si creano dei varchi sulla membrana esterna che permettono alla fucsina di colorare questi batteri.

Ci sono due teorie sulla colorazione di Gram:

  • Meccanica: se si assume che il peptidoglicano, formato da numerosi composti idrofili, possa essere assimilato ad una spugna, mantenendo per lo stesso tempo di esposizione al colorante un batterio Gram+ ed un batterio Gram-, il primo avrà assorbito una maggiore concentrazione di violetto di genziana perché ha uno strato di peptidoglicano più grande, mentre il secondo batterio lo ha molto più sottile. Quando poi si aggiunge un decolorante, mantenendolo per lo stesso tempo su entrambi i due tipi di batteri, sul batterio Gram- esso estrae la maggior parte di quello che è entrato (che è comunque poco visto la presenza della membrana esterna e lo strato sottile di peptidoglicano, che non permette un accumulo importante al suo interno di colorante), mentre il batterio Gram+ avrà assorbito così tanto violetto di genziana che è rimasto intercalato nelle maglie del peptidoglicano, inoltre può essersi depositato anche un po’ al di sotto. Dopo aver aggiunto il colorante di contrasto, la cellula viola rimarrà tale perché non può assorbire altro colorante, mentre l’altra cellula si colorerà con il colorante di contrasto perché non è riuscita ad assorbire il violetto di genziana, inoltre l’azione del decolorante ha indotto una parziale rottura della membrana esterna, con la formazione di numerosi pori, che faciliterà l’ingresso e la colorazione di questa cellula con la fucsina diluita.
  • Chimica: nei batteri Gram+ si forma un complesso violetto idrofobico che non può essere facilmente estratto con l’azione del decolorante, che colora di viola il batterio. I batteri Gram- invece vengono colpiti dall’azione del decolorante e viene degradata buona parte della membrana esterna, permettendo così una maggiore penetrazione di fucsina diluita (che colora il batterio di rosso).

Ci sono anche dei batteri definiti Gram Limite o Gram Variabile, che sono i Corinebatteri, tra cui citiamo l’agente eziologico della difterite. La colorazione di Gram è importante per sapere quale tipo di terapia usare in un’infezione, perché se c’è un batterio Gram+ si possono usare tutti gli antibiotici β-lattamici, a meno che il batterio non abbia messo in atto dei meccanismi di resistenza e allora si va a descrivere l’antibiogramma, ovvero andiamo a fare una determinazione della sensibilità dei batteri agli antibiotici, usando dei metodi di laboratorio molto semplici. Su un batterio Gram- che si è colorato di rosso andranno invece utilizzati degli altri antibiotici che agiscono sui ribosomi (ad esempio la streptomicina o la gentamicina) o quelli che agiscono sulle topoisomerasi (come i chinoloni), teniamo però in considerazione che non sempre si ha la certezza che la colorazione sia avvenuta bene.