Anticorpi IgG e IgM in microbiologia

Con questo tipo di diagnosi si ricerca il microrganismo a livello del siero, in particolare si ricercano gli anticorpi.
Ogni volta che l’organismo incontra un non self, un antigene estraneo con i suoi epitopi, contro questo viene evocata la risposta anticorpale, svolta da classi di Abs diverse tra loro: prima intervengono le IgM e poi le IgG, che possono avere un diverso grado di affinità, cioè legano con diversa potenza l’epitopo sull’Ag che ha evocato la loro produzione. La complementarità Ab-epitopo a volte è altissima e su questo si basano le indagini sierologiche. Nell’ambito della sierodiagnosi non si parla più di microbi, ma di Abs prodotti contro un certo microrganismo.

Si parte dal dogma per cui se ci sono Abs specifici per un certo Ag, quello era o è presente nell’ospite, inoltre spesso non basta dire che è presente un certo Ab contro un certo Ag, ma bisogna determinare anche il titolo anticorpale.

Ogni volta che un Ab riconosce l’Ag che gli è complementare si forma un immcomplesso, caratterizzato da un legame che ha una certa avidità, affinità e specificità e su questi parametri sono stati stabiliti dei percorsi diagnostici che, di solito nel giro di qualche ora, permettono di dire se nel siero di quel paziente ci siano certi Abs e quanti ce ne sono. Si va dunque a verificare se si è formato l’immunocomplesso, sfruttando certi epifenomeni che si verificano ogni volta che si forma.

La diagnosi sierologica prevede una serie di test di laboratorio:

  1. Precipitazione
  2. Agglutinazione
  3. Neutralizzazione
  4. Fissazione del complemento
  5. Fluorescenza
  6. Western blot
  7. ELISA

Un’unica indagine sierologica purtroppo può non essere sufficiente, può essere necessario ripeterla a distanza di tre settimane. Quindi si fornisce prima un risultato preliminare, poi uno definitivo a distanza di qualche settimana. La risposta anticorpale ha delle cinetiche molto precise, quindi facendo due prelievi e confrontando la presenza di Abs e il titolo anticorpale si può stabilire se ci sia o meno una infezione. I primi Abs prodotti sono le IgM, che vengono sempre prodotte 12-15 giorni dopo un contatto con un microrganismo e vanno scomparendo dopo un mese o due: se alla prima analisi si rilevano molte IgM contro un virus allora si può affermare con certezza che quell’individuo è infetto da quel virus. Ma se anziché le IgM egli avesse le IgG contro lo stesso virus, non si può dire niente di certo, perché potrebbe essere un soggetto vaccinato, uno che è infetto da 4 mesi od una persona che potrebbe aver contratto l’infezione 10 o 15 anni prima.

In alcuni casi, ad esempio quando c’è una IgG-positività, si ripete il test a distanza di almeno un mese. Se sono presenti delle IgG che restano stabili a distanza di 4 settimane si può soltanto dire che quella persona ha avuto in passato un contatto con quel microrganismo. Si può escludere che ci sia un’infezione in corso perché se ci fosse il livello delle IgG andrebbe aumentando o diminuendo (se il soggetto è convalescente). I due campioni vengono usati molto spesso e l’esame comparativo aiuta a stadiare l’infezione. Si parla di sieroconversione quando il titolo anticorpale cambia di almeno quattro volte tra il primo e il secondo prelievo e si traduce con la diagnosi di un’infezione in corso.

 

PRECIPITAZIONE e AGGLUTINAZIONE

La precipitazione e l’agglutinazione sono simili: si parla di precipitato o di agglutinato ogni volta che un Ag incontra un Ab: se l’Ag è solubile si ha la precipitazione, se è corpuscolato si parla invece di agglutinazione, ma in ambo i casi si forma un precipitato visibile. Nel caso della precipitazione è difficilmente visibile, ci vogliono 18 ore e necessita di un sistema di diffusione in agar, allora si forma un alone dove c’è l’aggregazione Ag-Ab. I tempi tecnici lunghi fanno si che l’utilizzo della precipitazione sia limitato. Con l’agglutinazione invece in 5 minuti si ha un campione che rimane trasparente se è negativo, mentre se è positivo compaiono dei flocculi, dei granuli macroscopicamente visibili. Funziona come nella diagnosi diretta, ma stavolta si cerca l’Ab e non l’Ag.

FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO

È una tecnica complessa basata sul principio secondo cui il complemento, quando si trova in presenza di un immunocomplesso, certamente si attiva. L’ultimo atto del processo di attivazione del complemento è la lisi della cellula bersaglio a cui si è legato l’Ab. Questo test si fa di solito quando non ci sono alternative e consta di due fasi:

  • Nei pozzetti si mettono diluizioni scalari del siero in cui si sospetta ci sia l’Ab contro un certo Ag, poi si aggiungono:
    • l’Ag noto che si sospetta
    • il complemento

Se c’è una complementarità con l’Ag noto si formerà l’immunocomplesso ed a questo si legherà il complemento

  • Si aggiunge nei pozzetti il sistema di rilevazione, cioè dei globuli rossi di montone e degli Abs anti-globulo rosso:
    • se il complemento è tutto fissato, non ce ne sarà di libero perché lavora in situazione di superabbondanza
      • in questo caso la reazione è positiva e nei pozzetti si vedranno degli spot rossi ben delineati, che non sono altro che emazie precipitate perché integre dato che il complemento è tutto fissato all’immunocomplesso
    • se invece non c’è stata la fissazione perché non c’era l’Ag sospettp, allora il complemento è libero e si trova a poter reagire con i globuli rossi ed il Ab anti-globulo rosso. La conseguenza di questa reazione sarà la lisi del globulo rosso
      • in questo caso la reazione è negativa e nei pozzetti si vede un’area rossa più diffusa perché c’è stata l’emolisi (il siero è talmente diluito che non riesce più a fissare il complemento e compare la lisi del globulo rosso)

 

NEUTRALIZZAZIONE

In molti casi gli Abs sono in grado di legare ed inattivare le tossine e la stessa cosa vale per i virus. In questi test si utilizzano appunto virus o tossine con la loro cellula di riferimento (cioè la cellula sensibile a quel virus o a quella tossina) e a questo sistema biologico si aggiunge il siero del paziente opportunamente diluito, perché anche in questo caso si vuole determinare un titolo. Si prendono delle colture cellulari che vengono incubate in presenza di un virus pretrattato col siero del paziente: se nel siero del paziente ci sono gli Abs questi legano il virus, che non potrà sortire i suoi effetti citopatici.

FLUORESCENZA

La fluorescenza è molto usata in virologia, soprattutto per la diagnosi diretta. Nel caso della sierodiagnosi, anche nella fluorescenza così come per l’agglutinazione e la precipitazione, il metodo è lo stesso ma anziché l’Ag si cerca l’Ab: si utilizza un vetrino dove ci sono gli Ag di interesse, cioè un vetrino dove sono state spottate le cellule infette, si aggiunge poi il siero del soggetto. Se contiene gli Ab contro gli Ag spottati sul vetrino, si lega ad essi e il legame si rende visibile trattando con l’Ab secondario che sarà rodaminato o fluoresceinato.

ELISA

In ELISA l’Ag viene spottato sul fondo dei pozzetti, poi si aggiunge il siero del soggetto e degli Abs anti-Ig. Se sono anti-IgM rileveranno le IgM, se sono anti-IgG rileveranno le IgG. Il vantaggio dell’ELISA è che si può fare in micropiastra, si possono fare diluizioni scalari ed arrivare a dare un valore quantitativo, si può definire il titolo anticorpale in quel particolare soggetto. Questo è un percorso diagnostico che viene utilizzato moltissimo.

WESTERN BLOT

Consiste nella ricerca di particolari proteine, gli Abs, in un campione biologico. Viene utilizzato nella diagnosi di infezione da HIV. Il test consiste nel fare una corsa elettroforetica su gel ad un estratto di virus e le varie proteine di HIV si distribuiranno in base alla dimensione, dando origine a delle bande. Dopo l’elettroforesi si fa il blottaggio (passaggio in un supporto di nitrocellulosa o nylon) e poi si aggiunge il siero del paziente: se ci sono Abs contro gli Ags di HIV si legheranno ad essi. C’è la necessità di Abs primari (siero del paziente) e secondari (Abs coniugati con fluorocromi o enzimi). Se si utilizza un Abs secondario coniugato con un enzima, bisogna aggiungere anche il substrato per quell’enzima. Alla fine del percorso di lavoro (sono tempi lunghi, si parla di circa due giorni) si cercano le bande, che corrispondono ai siti in cui il siero del soggetto ha riconosciuto l’Ag corso il giorno prima, che viene riconosciuto dall’Ab secondario, che a sua volta lo mette in evidenza con un segnale fluorescente o comunque colorato.

 

Limiti e vantaggi della diagnostica sierologica

La sierologia si fa per quei patogeni che sono lenti o difficili da coltivare. Se si rilevano delle IgM si può fare la diagnosi immediatamente, perché esse si associano a un’infezione di pochi giorni, se invece si rilevano delle IgG bisogna sempre confrontare i due prelievi fatti a distanza di 3-4 settimane, in questo caso per fare la diagnosi d’infezione si deve rilevare un aumento di almeno quattro volte del titolo anticorpale. La ricerca di Ab è assolutamente inutile negli immunodepressi, negli anziani e nei neonati.