Anticorpi ANA, anti-DNA, ENA, ANCA e anti-fosfolipidi

Parlando dei test di laboratorio di autoimmunità sono rilevanti soprattutto le patologie autoimmuni sistemiche (soprattutto le connettiviti e le vasculiti che sono le patologie più specifiche e peculiari nel campo reumatologico).
Sono patologie rare che colpiscono solo lo 0,5 % della popolazione, ma sono molto serie dal momento che possono interessare più organi e portare a morte il paziente. È molto importante riconoscerle per il medico di medicina generale, in maniera tale da poter inviare il paziente agli specialisti. Sono anche patologie piuttosto subdole, in alcuni casi è difficile individuarle con sicurezza, ci sono pazienti su cui si riesce a fare diagnosi anche 10 anni dopo. 

Sono caratterizzate dalla presenza di auto-anticorpi (auto-AB o autoantibodies), contro il self, che possono nascere per motivi diversi. Per il laboratorio di autoimmunità è importante individuarli per associarli ad una certa patologia, alcuni saranno predittivi di patologia, altri markers di patologia e altri ancora importanti per la prognosi.

Possono essere organo specifici e non organo specifici (anti-nucleo o citoplasma), quelli che per il laboratorio sono più importanti sono i non organo specifici. Alcune volte però questi auto-AB si possono trovare in soggetti sani o che non hanno queste patologie, quindi trovare l’anticorpo non sempre è un dato sicuro che ci indirizza verso la diagnosi di malattie autoimmuni sistemiche.

 

ANA (auto-anticorpi anti-nucleo)

Si è calcolato che il 5 % circa della popolazione giovane (sopra i 65 anni si arriva al 10 %) avrà gli auto-AB antinucleo (ANA) misurati con l’ANA-test, senza essere necessariamente malati o comunque senza avere necessariamente patologie autoimmuni, ad esempio:

  • Individui sani
  • Epatopatie
  • Epatiti croniche attive (HCV positive hanno ANA nel 30 % dei casi o più)
  • Cirrosi biliare primitiva
  • Epatiti alcoliche
  • Patologie polmonari
  • Fibrosi
  • Asbestosi
  • Infezioni croniche (ad esempio TBC)
  • Neoplasie
  • Linfomi
  • Leucemie
  • Melanomi
  • Tumori solidi
  • Varie
  • Endocrinopatie
  • Sclerosi multipla
  • Post-trapianto d’organo

Prendiamo ad esempio il lupus eritematoso sistemico, è la malattia autoimmune per eccellenza ed in cui nel 95 % dei casi troviamo un ANA-test positivo (praticamente sempre), la sua incidenza è 1 caso su 2000 soggetti. Però su 2000 persone circa, 100 avranno un ANA-test positivo indipendentemente dal fatto che abbiamo una patologia autoimmune o meno, quindi di questo centinaio di persone solamente 1 avrà il LES.

 

ANA-TEST: IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA

Gli ANA sono anticorpi di classe IgG, esistono anche auto-AB di classe di IgM ma si studiano solo per la ricerca, non negli esami di routine. Per individuare gli ANA in un siero si usa l’immunofluorescenza indiretta, è abbastanza facile da eseguire, è sensibile e costa poco, però è un test operatore dipendente. Soltanto centri dedicati danno risultati sicuri. È un test che ci permette di individuare la presenza di un particolare tipo di auto-AB nel plasma di un paziente, quindi non è specifico esclusivamente per ANA.

Metodica: prima di tutto si parte da un prelievo di sangue, successivamente si ottiene dal sangue intero il siero e poi si eseguono delle diluizioni del siero ottenuto: si inizia con una diluizione “1 a 40”, una parte di siero e 39 parti di fisiologica. Prendiamo poi 1 ml di siero “1 a 40” e lo misceliamo a 1 ml di fisiologica ottenendo così una diluizione “1 a 80” e così via ottenendo “1 a 160”, “1 a 320” ed oltre, con diluizioni per raddoppio.
A questo punto posizioniamo il siero del paziente (con le sue varie diluizioni) su un vetrino su cui abbiamo HEp2 cells, sono cellule tumorali di tumore della laringe che vengono coltivate per avere un gruppo di cellule standard da utilizzare per questo esame. Se nel siero c’è l’anticorpo che ci interessa esso legherà al suo Ag presente nelle cellule HEp2 che sono cellule grosse e in continua mitosi quindi riescono a darci, nel complesso, tutta la serie di Ag che una cellula esprime in tempi diversi a seconda della fase del ciclo cellulare in cui si trova. Dopo mezzora laviamo via gli eccessi di anticorpi che non sono riusciti a legarsi. Nel caso degli ANA però ci si potrebbe chiedere come gli anticorpi antinucleo raggiungano il loro target essendo le cellule integre, per ovviare a questo problema si tratta il vetrino con alcol metilico, che oltre a fissare le cellule le rende anche permeabili agli ANA.
Dopo il lavaggio degli anticorpi in eccesso aggiungiamo sul vetrino IgG anti IgG umane fluorescenti, che si legano ai nostri anticorpi legati a loro volta alle cellule sul vetrino al vetrino, si potrà così metterli in evidenza. Con il microscopio a fluorescenza avremo le zone positive verde brillanti (dove si è legato il nostro anticorpo) e in nero avremo le zone negative.

Avremo come titolo del nostro anticorpo la diluizione maggiore in cui ancora il test risulta positivo, a partire da almeno una diluizione “1 a 80” (ad esempio il risultato può essere ANA positivo su HEp2 cell con titolo “1 a 160”), più il titolo è alto più abbiamo anticorpi nel plasma, perchè nonostante le diluizioni sono ancora molto presenti, quindi vuol dire che già in partenza erano molti. In laboratori non specializzati il test viene condotto in maniera non corretta, a volte immuno-enzimatica i cui risultati ci interessano poco. Oppure un tempo si utilizzavano ma interi tessuti di ratto (e non tappeti cellulari di HEp2) che non possono darci la varietà completa di Ag che le HEp2 ci danno, si hanno soltanto alcuni tipi di pattern limitati.

Molto importante è individuare il pattern di fluorescenza, andiamo a vedere prima di tutto cosa abbiamo nelle cellule Hep2:

  • cellula in interfase: cellule di forma fusata con citoplasma, nucleo in zona centrale con la sua superficie, nucleoli e cromatina
  • cellula in mitosi: cellule di forma rotondeggiante con citoplasma e in zona centrale i cromosomi

TIPI DI PATTERN di Hep2

  1. Pattern omogeneo: come possiamo vedere qui la fluorescenza è abbastanza diffusa e omogenea. Ben visibile il nucleo (grande) e anche il citoplasma (in verde meno intenso). É un pattern aspecifico.
  2. Pattern periferico: è rarissimo, ha zona centrale verde omogenea e un bordo, la zona intorno al nucleo è molto evidente. Pattern tipico del LES, ma solo in un piccolo numero di casi di LES (ma se c’è, è per forza LES).
  3. Pattern punteggiato: il punteggiato può essere grossolano oppure molto fine (quasi uniforme). È un pattern aspecifico.
  4. Pattern anticentromero: gli anticorpi sono contro i centromeri, infatti possiamo notare nella cellula in mitosi come sia verde la zona del centromero. Nel 90 % dei casi indica sclerodermia.
  5. Pattern nucleolare: in cui sono ben visibili i nucleoli (essendo cellule tumorali ne hanno tanti), quindi gli anticorpi sono antinucleolo. È un pattern aspecifico.

 

UTILITA’ DELL’ANA-TEST

Non ha senso fare uno screening sull’ANA perchè molti soggetti sani avrebbero risultati positivi, o comunque potrebbero essere soggetti non colpiti da patologie autoimmuni. L’ANA è considerato un semplice epifenomeno ma non la causa di danno della patologia. Non c’è infatti un rapporto tra titolo dato dall’ana-test e gravità della patologia (in alcuni casi posso avere titolo basso e patologia gravissima e viceversa). Non essendoci rapporto tra attività della malattia e titolo, se abbiamo un sospetto clinico ma titolo basso si manda lo stesso il soggetto da un reumatologo. Inoltre non ha senso fare l’ANA-test per verificare l’andamento di una terapia cortisonica in un soggetto con patologia autoimmune sistemica, perchè potrebbe rimanere alto indipendentemente dalla buona riuscita della terapia.

 

 

ANTICORPI ANTI-DNA

Un altro tipo di auto-anticorpo importante nelle patologie autoimmuni sistemiche è quello degli anticorpi-anti DNA a doppia elica (nativo, quello a singola elica è denaturato), è un anticorpo che è già patogenetico, al contrario di ANA che è solo un epifenomeno, è per questo che gli anti-DNA vano controllati nel tempo durante il follow-up.

Si può individuare con varie metodiche, immunoenzimatiche, radioimmunologiche, ecc… . Il test che noi utilizziamo (che è anche il più economico) è l’immunofluorescenza indiretta su vetrini con “crithidia luciliae”, che è un parassita emoflagellato che presenta un ampia rete di dsDNA (DNA nativo) chiamata chinetoplasto. La metodica immunoenzimatica spesso faceva si che il DNA denaturasse e quindi l’anticorpo che si individuava era contro DNA denaturato, in questo caso invece il DNA del chinetoplasto è nativo e l’anticorpo trovato non può che essere anti-DNA nativo. Gli anti-DNA sono molto specifici, quando un paziente è anti-DNA positivo nel 90 % è un caso di LES.

 

ENA

Gli ENA antigeni nucleari specifici, quando li troviamo di solito il paziente ha una patologia autoimmune. Si individuano con tecniche immunoenzimatiche. Noi ne studiamo 7/8, solo quelli che riusciamo ad associare ad un problema clinico:

SM: sospetto LES, è poco sensibile (c’è solo nel 10/30 % di LES) ma se c’è, è per forza LES, inoltre il nome deriva da Smith, che è stato il primo paziente in cui è stato trovato questo anticorpo.

RNP: connettivite mista (molto rara) o subset di LES, sono anti-ribonucleoproteina.

SSA: subset di LES o sindrome di Sjogren (secchezza agli occhi ed in bocca e in alcuni pazienti linfomi e patologie importanti).

SSB: subset di LES o sindrome di Sjogren.

SCL-70: sclerosi sistemica progressiva. Abbiamo visto prima che un pattern di fluorescenza anticentromero è legato ad una sclerodermia limitata, in questo caso invece si avrà una sclerosi sistemica progressiva con un quadro polmonare.

JO-1: polidermatomiosite, malattia rara ma gravissima con un quadro muscolo-cutaneo e problemi respiratori. Anche qui il nome deriva dalla sigla della provetta in cui è stato identificato la prima volta.

Istoni: LES da farmaci, LES e in pazienti sani.

Nucleosomi: LES.

 

COME SI PROCEDE CON I VARI TEST?

I test per gli autoanticorpi si fanno solo quando sospettiamo una patologia. Con il ANA-test, se è negativo completamente ci si ferma li (di solito), se è positivo si fanno anche gli altri test. Per quanto riguarda i pattern che possiamo trovare, un punteggiato di solito è un ENA associato, mentre un omogeneo è un anti-DNA associato.

 

ANCA (anticorpi anticitoplasma dei neutrofili)

Normalmente sono utilizzati per le vasculiti (che sono molti rare). Abbiamo due pattern diversi di ANCA all’immunofluorescenza indiretta:

  • C-ANCA (citoplasmatici)

Il citoplasma è completamente verde, è visibile la classica forma dei nuclei dei neutrofili.

  • P-ANCA (perinucleari)

In questo caso invece la fluorescenza è tutta intorno al nucleo. Nel caso si abbia un immunofluorescenza positiva per ANCA, si passa ad una metodica di immunoenzimatica per capire con precisione contro cosa sono gli anticorpi trovati.

C-ANCA: di solito con questo pattern siamo di fronte alla presenza di anti “Proteinasi 3”, questo quadro è associato al morbo di Wegener, è una patologia estremamente grave con una granulomatosi diffusa che può portare il paziente alla morte (possono esserci quadri apparentemente banali con interessamento di distretti non vitali come orecchi o naso, ma possono complicarsi in maniera drammatica). L’anti-proteinasi 3 è anche associato anche a micropoliangioite.

P-ANCA: il pattern p-ANCA ha invece più possibilità:

  • anti-Mieloperossidasi, che è comunque la più importante, questo anticorpo è associato al morbo di Churg-Strauss o alla micropoliangioite
  • anti-lattoferrina, associato a LES, artrite reumatoide e Morbo di Crohn
  • anti-catepsina G, associato alla rettocolite ulcerosa
  • anti-antigene sconosciuto, associato a epatite cronica

 

ANTICORPI ANTI-FOSFOLIPIDI

Individuati nel 1983 da Harris, la loro scoperta è stata importantissima per i pazienti con LES o connettiviti, infatti la loro presenza è responsabile di trombofilia assoluta con alto rischio di trombosi in distretti importantissimi come quello cerebrale, cardiaco od intestinale. Questa trombofilia molte volte compare già in età giovanile (pazienti che iniziano ad avere ictus già a 16-20 anni).

Un tempo si trattavano questi pazienti con grandi quantità di cortisone (senza successo) oggi sappiamo che dietro questa trombofilia assoluta ci sono anticorpi anti-fosfolipidi, soprattutto fosfolipidi a carica negativa (fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, ecc…). Tre gruppi di ricercatori indipendenti hanno poi scoperto che molte volte l’anticorpo anti-cardiolipina (un fosfolipide) non si lega direttamente ai fosfolipidi ma tramite una proteina plasmatica, la beta2 glicoproteina 1, quindi in realtà l’anticorpo è contro la proteina e non contro il fosfolipide, il risultato è sempre una trombofilia.

 

LAC (LUPUS ANTICOAGULANT)

Questo nome dato ad un gruppo di anticorpi è fuorviante, infatti in vitro abbiamo una situazione anticoagulante ma in vivo c’è comunque un effetto protrombotico. In vitro infatti avremo tempi di coagulazione molto allungati. Molte volte abbiamo dei soggetti giovani che fanno test di coagulazione in preparazione ad interventi o donazioni e trovano tempi di coagulazione allungati. A questo punto si indaga e si ricercano autoanticorpi. La presenza di LAC determina in vitro una ritardo nella conversione di protrombina in trombina, prolungando tutti i test fosfolipido dipendenti in particolare il PTTa.

 

QUANTI SONO GLI AUTO-AB?

Sono tantissimi, in un LES ne sono stati scoperti 116 (al momento) il lupus è il prototipo della presenza di auto-AB, contro molti target diversissimi tra loro (anti piastrine, anti rossi, anti leucociti, anti Ig,…). Quindi per clinica ne studiamo un numero limitato, ma per ricerca ne individuiamo molti di più. Trovarli è utile come abbiamo già detto per individuare le patologie autoimmuni e alcuni ci indicano con precisione a che livello è il danno, contro quale organo.

 

TIMING DEGLI AUTO-AB

Un tempo quando si individuava un auto-AB ci si fermava li, oggi si sa che invece c’è un preciso timing. Ad esempio nel LES prima compaiono quelli anti-fosfolipidi e anti-SSA/SSB detti anche rispettivamente anti-ro/la (3-4 anni prima della patologia), poi gli anti-DNA (2-4 anni prima), infine compaiono gli anti SM e gli anti RNP (1-2 anni prima) ed a questo punto si avrà il LES.