Struttura delle proteine

In questo corso parleremo della materia e delle reazioni che la interessano. Vogliamo ora trattare le reazioni, i processi tramite i quali siamo in grado di produrre energia, senza la quale non potrebbero avvenire quei fenomeni che sono alla base dei meccanismi della vita.
Tratteremo i processi che portano dai carburanti all’acetil-CoA, fondamentale perché avvenga la respirazione cellulare, le varie forme in cui viene immagazzinata l’energia e molte reazioni che avvengono nella materia vivente.

 

ATP (adenosina trifosfato)

Questa molecola viene chiamata “moneta energetica”. L’energia viene raccolta e distribuita attraverso questa molecola. L’ATP si forma dall’ADP (adenosindifosfato).

L’ADP viene fosforilato, quindi, per formare ATP. L’attacco del fosfato inorganico al secondo fosfato dell’ADP è una reazione fortemente endoergonica, quindi per farla avvenire occorre fornire energia. Nei processi che per avvenire necessitano di energia si ha l’idrolisi del legame tra il terzo ed il secondo fosfato con conseguente liberazione del terzo fosfato che spesso si legherà ad un’altra molecola formando un estere fosforico. In realtà anche il legame anidrilico tra il primo ed il secondo fosfato è un legame altamente energetico, ossia occorre fornire molta energia per formarlo e allo stesso modo libererà molta energia una volta idrolizzato. Questa idrolisi fornirà circa la stessa energia fornita dall’idrolisi del legame tra il terzo ed il secondo fosfato. Anche l’ADP viene utilizzato come molecola energetica nel caso in cui il bisogno di energia sia molto forte (ad esempio nel muscolo). L’AMP è invece un indicatore del basso livello di energia. L’accumulo di ADP significa basso carico energetico, ci si aspetta quindi che un accumulo di questa molecola favorisca il catabolismo e contemporaneamente inibisca l’anabolismo, al contrario l’accumulo di ATP è segno di un alto carico energetico, quindi verrà inibito il catabolismo e stimolato l’anabolismo. Il valore del rapporto ATP/ADP è uno dei termini che dà la corretta direzione al processo (anabolico o catabolico a seconda del valore del rapporto) e ne conferisce la giusta velocità.

La complessa rete delle reazioni chimiche che si svolgono nel corso del metabolismo avviene in presenza di enzimi. Questi sono dei catalizzatori capaci di aumentare notevolmente la velocità delle reazioni abbassandone l’energia di attivazione. Gli enzimi forzano le vie metaboliche attraverso reazioni selezionate, non casuali, in quanto l’enzima non agisce a caso su qualsiasi trasformazione subisca il substrato, ma ne favorisce in maniera determinante alcune, quelle più convenienti. La molecola che viene trasformata nella reazione catalizzata dall’enzima si chiama substrato. Le reazioni metaboliche possono essere regolate attraverso gli enzimi. Esistono diverse classi di enzimi. Gli enzimi regolatori hanno la funzione di modulare le velocità delle varie tappe delle reazioni (ricordiamo che le reazioni biochimiche sono concatenate) e così facendo modulano anche il flusso dei metaboliti. Esistono diversi meccanismi di regolazione:

  • REGOLAZIONE ALLOSTERICA: un modulatore o regolatore si lega all’enzima non nel sito attivo (dove si inserisce il substrato), ma in un’altra zona e modificando la struttura del sito attivo ne modifica anche l’attività catalitica.
  • REGOLAZIONE COVALENTE: il legame covalente tra enzima e regolatore (tipicamente un fosfato donato dall’ATP) modifica (stimola o inibisce) l’attività enzimatica. Il fosfato è trasferito dall’ATP sull’enzima da un altro enzima (cinasi, appartenente alla classe tranferasi). L’idrolisi del legame enzima-fosfato avviene ad opera di una fosfatasi che ripristina l’attività nativa dell’enzima. Le cinasi e le fosfatasi sono controllate da ormoni.
  • REGOLAZIONE GENICA: l’espressione genica può essere modulata e se noi aumentiamo la produzione dei geni che codificano per un enzima aumentiamo anche la sua attività, se aumentiamo il numero di molecole prodotte a livello genico di un enzima aumentiamo l’attività dell’enzima stesso.

 

Gli Ormoni

Essi sono prodotti da apposite ghiandole. L’ipotalamo produce vari tipi di ormoni che vanno a condizionare la secrezione di altri tipi di ormoni da parte di altre ghiandole o organi, ad esempio l’ipofisi, la tiroide, le ghiandole surrenali, le isole del Langherhans (insulina e glucagone), le ovaie e il testicolo.

Gli ormoni vengono anche chiamati “molecole magiche” in quanto, sebbene presenti in piccolissime concentrazioni influiscono in modo molto marcato sui vari processi metabolici.

 

Proteine

STRUTTURA PRIMARIA: sequenza degli aminoacidi che compongono la proteina

STRUTTURA SECONDARIA: in dipendenza dalle interazioni tra i radicali, pH e ambiente in cui si trova la catena polipeptidica, la struttura secondaria rappresenta il modo in cui gli aminoacidi si ripiegano localmente. Questa struttura è stabilizzata da legami ad idrogeno. Esistono diversi tipi di strutture secondarie:

l’α elica è la più comune, la si ritrova sia nelle proteine fibrose che in quelle globulari. Pauling e Corey per primi ipotizzarono questo modello utilizzado dati ottenuti attraverso raggi X, Perutz (scopritore dell’emoglobina) ritrovò l’α elica in molte proteine. Il passo della spirale è costituito da 3.6 aminoacidi, ogni carbonio è legato con un legame ad idrogeno all’azoto del quarto residuo successivo. Da questo scopriamo che tutti i gruppi carbonilici sono legati a quelli amminici.

AMINOACIDI CHE STABILIZZANO L’α ELICA AMINOACIDI CHE DESTABILIZZANO L’α ELICA AMINOACIDI CHE INTERROMPONO L’α ELICA
Leucina, Alanina,Triptofano… Serina, Arginina, Aspartato… Prolina e ossiprolina

Un’altra struttura secondaria importante è quella a β-foglietto, che mantiene fino a 5 catene polipeptidiche affiancate legate da legami idrogeno. Infine sono considerate strutture secondarie anche le anse e le pieghe tra una struttura secondaria caratteristica e l’altra.

STRUTTURA TERZIARIA: è un ripiegamento della struttura secondaria, ciò porta alla proteina globulare. Le interazioni idrofobiche rappresentano le forze più importanti per il mantenimento della struttura terziaria, ma anche i legami covalenti sono presenti con una buona percentuale.

STRUTTURA QUATERNARIA: aggregazione di più strutture terziarie (emoglobina), caratterizzate dagli stessi legami che stabilizzano la struttura terziaria.

 

LEGAME CARBOAMIDICO: legame che si ritrova tra due aminoacidi adiacenti. Esso consiste nel legame tra carbonio carbonilico di un aminoacido e l’azoto dell’aminoacido successivo. Ci sono 2 possibilità conformazionali per queste strutture, una TRANS e l’altra CIS, negli aminoacidi per un fatto di ingombro sterico e di interferenze tra i radicali, troviamo la struttura TRANS. Il legame carboamidico ha per il 40% le caratteristiche del doppio legame. Di conseguenza le possibilità conformazionali sono limitate, perché la rotazione non è permessa e i 4 atomi (N,Cα,C,Cα) si trovano tutti sullo stesso piano. La rotazione è permessa solo tra Cα e C carbonilico, e tra Cα e N. L’angolo tra C e Cα si chiama psi ψ, quello tra C e N phi φ. I piani che contengono il legame peptidico si dispongono nello spazio in dipendenza dagli angoli di rotazione. A causa dell’ingombro sterico non sono possibili tutti gli angoli di rotazione, abbiamo quindi dei limiti nella rotazione di questi legami affinchè le catene laterali non collidano. Si possono calcolare le conformazioni consentite calcolando la distanza tra gli atomi, sono proibite le conformazioni in cui gli atomi sono più vicini tra loro rispetto a quanto lo sarebbero con l’insorgere delle forze di Van der Waals. Esiste un diagramma, il diagramma di Ramachandran in cui sono graficati gli angoli φ e ψ consentiti. In questo modo, per ogni data coppia di angoli φ e ψ si può prevedere se la conformazione che originerebbe potrebbe essere consentita.

Le catene polipeptidiche hanno un’ossatura di base, uno scheletro o spina dorsale (backbone) costituito dal ripetersi nello spazio di una stessa sequenza di atomi: Cα-C-N- Cα-C-N-Cα-C-N-…

L’aminoacido iniziale di una proteina ha il gruppo amminico libero, quello finale possiede un carbossile libero. Non tutte le proteine utilizzano tutti e 20 gli aminoacidi.

Gli aminoacidi che ci riguardano sono dei levo-aminoacidi. I radicali appartenenti ai vari aminoacidi sono molto importanti, perché dal loro comportamento dipende la struttura che la proteina da essi costituita assumerà. La conformazione di una proteina è determinata dai gruppi polari e apolari posseduti dagli aminoacidi. Poiché l’ambiente cellulare è un ambiente acquoso, i gruppi apolari cercano di non venire in contatto con questo ambiente, e per interazione idrofobica (spinta a sottrarsi all’interazione con le molecole di acqua), si forma all’interno della proteina un ambiente idrofobico contenente solo gruppi apolari. Ciò porta alla conformazione ripiegata. Un tipico esempio è la molecola dell’emoglobina che deve tenere lontano dall’acqua il gruppo EME,visto che questo deve trasportare ossigeno.

 

LEGAMI DISOLFURO e LEGAMI IDROGENO
I legami disolfuro si formano tra residui di cisteina attraverso l’ossidazione di 2 gruppi SH. Il ponte disolfuro è presente nelle molecole di insulina. I ponti disolfuro possono trovarsi su catene diverse, ovvero si formano legami INTERCATENA, oppure sulla stessa catena, come nell’insulina, in questo caso formano le ANSE

Per attraversare la membrana cellulare occorrono sequenze aminoacidiche di almeno 20 aminoacidi idrofobici. I legami ad idrogeno invece si possono formare tra 2 filamenti proteici diversi o all’interno dello stesso.

 

Struttura a foglietti b

La b-struttura, che presenta una spina dorsale a pieghe, è detta anche struttura a foglietti-b perché normalmente si tratta di più catene polipeptidiche che si affiancano e danno luogo al foglietto.

Queste catene, trasversalmente, sono legate da legami idrogeno che si comportano come nella a-elica, i gruppi coinvolti sono gli stessi (è come stirare una a-elica). Questi foglietti si sovrappongono: per questo prevalgono amminoacidi con il radicale piccolo (soprattutto alanina e glicina).

I legami idrogeno si creano dunque fa l’NH di un polipeptide e il COO del polipeptide che affianca il primo. Le catene b possono essere parallele o anti-parallele, in base all’orientamento del gruppo NH2 iniziale e del COOH finale (la proteina inizia infatti con un gruppo amminico libero e termina con un gruppo carbossilico libero, non impegnati in legami peptidici).

 

Proteine globulari

Le proteine globulari sono la classe più numerosa, le altre due classi sono le proteine fibrose e quelle di quelle di membrana. Una proteina globulare è formata da segmenti a-elica e b-foglietto, i foglietti b (in rosso) non sono rappresentati come nella realtà fisica della catena, ma alludono alla struttura senza rappresentarla.

Sia le a-elica che i foglietti b sono diritti: cosa succede quando una catena vuole cambiare direzione, se vuole “voltare”, per poter formare una proteina globulare? Quando deve cambiare direzione deve formare curve, loop (lacci), che non hanno una struttura che si ripete (non sempre, per lo meno), cioè non si può individuare una struttura che si trova qui e che si trova anche in un’altra proteina. La maggior parte delle proteine ha struttura globulare, la catena polipeptidica deve quindi avere la possibilità di piegarsi e riorientarsi per produrre strutture compatte, un caso abbastanza frequente è che un gruppo polare formi un legame idrogeno con un amminoacido che si trova tre posti più avanti, con la formazione di una forcina. Fra i segmenti b ci sono connessioni di due tipi: a forcina e a ponte incrociato. Le forcine connettono filamenti b anti-paralleli mentre i ponti i crociati quelli paralleli.

 

Proteine di membrana

Caratteristica delle proteine di membrana: dove vengono a contatto con le catene di acidi grassi dei fosfolipidi di membrana l’interazione sarà favorita dalla disposizione di radicali aminoacidici idrofobici, quindi l’NH2 iniziale sporge nell’ambiente acquoso.

 

Proteine fibrose

Le proteine fibrose sono in minoranza. Sono allungate, il motivo dominante della loro struttura è la struttura secondaria. Sono le proteine di pelle, tendini ed ossa, ed hanno una funzione strutturale, protettiva e di connessione. Cristallizzano molto raramente, quindi non si può procedere con una cristallografia a raggi X come per l’emoglobina per poterle studiare, infatti abbiamo poche informazioni su di esse. Normalmente le proteine fibrose sono insolubili.

  • Le a-cheratine sono le proteine di peli, unghie e capelli, sono delle a-eliche coiled-coil (avvolgimento avvolto), ovvero ciascun filamento ha un avvolgimento elicoidale e si avvolge con l’altro. Sono strutture stabilizzate da legami idrogeno e legami disolfuro, durano a lungo, non sono reattive dal punto di vista chimico, si trovano nei vertebrati superiori, sono i principali componenti degli strati epidermici più esterni e cornificati. L’a-elica rappresenta il building block (unità strutturale), questa struttura può estendersi fino a comprendere centinaia di amminoacidi. In un’a-elica destrorsa gli amminoacidi idrofobici, in ogni unità ripetitiva danno luogo a una striscia che gira intorno all’elica, che ne segue l’andamento, la presenza di questi amminoacidi stabilizza con interazioni idrofobiche ogni avvolgimento. Le a-cheratine possono essere classificate in dure e soffici a seconda del contenuto di zolfo, dall’abbondanza di legami disolfuro che si formano dall’ossidazione dell’SH dei residui di cisteina. Noi non digeriamo le cheratine, proprio per via dei ponti disolfuro, le larve delle tarme hanno invece mercaptani nel tubo digerente e possono digerire la lana. L’uso del mercaptano rompe i legami disolfuro, e questi possono essere ricostituiti (nelle condizioni di ossidazione. I ponti disolfuro si possono quindi ridurre, staccando i due filamenti: per fare la permanente nei capelli bisogna riossidarli.
  • Le proteine b costituiscono la seta: aracnidi e insetti producono seta. Residui di alanina e glicina si incastrano con altri residui di alanina e glicina (su uno strato rispetto all’altro) per dare consistenza. La seta è costituita da fibroina e sericina (proteina gommosa) che cementa le fibre fra di loro, nella seta dei vestiti la sericina viene rimossa per la lavorazione.

 

Il collageno è fatto da un’unità strutturale di tre filamenti che si intrecciano fra loro (ma non ha nulla a che vedere con l’a-elica). Questi filamenti cambiano a seconda del tessuto dove il collageno viene formato, ed è diverso a seconda dei diversi organi. È consentito scambiare amminoacidi purché si conservi la stessa struttura È la proteina più abbondante, “tiene insieme l’organismo”, il tropocollageno è l’unità strutturale base. Sono abbondanti la glicina (che si trova ogni tre residui aminoacidici), la prolina e l’idrossiprolina (che si forma quando la prolina è già inserita nella catena peptidica, processo post-traduzionale, attraverso l’enzima prolina-idrossilasi), ma anche la lisina (idrolizzata dal’enzima lisil-idrossilasi). Ci sono almeno 20 tipi di collageno, sono fibre insolubili e ad elevata resistenza. Oltre all’idrossilazione, durante la maturazione la molecola di collageno subisce un processo di glicosilazione che riguarda i residui di lisina. A stabilizzare il collageno ci sono legami idrogeno intercatena (idrogeno legato covalentemente ad azoto ed elettrostaticamente ad ossigeno). Il processo di idrossilazione porta al residuo di 4-idrossiprolina, ma il processo di maturazione del collageno richiede la vitamina C (o acido ascorbico), senza la quale non può avvenire il processo ossidativo (ne risentono i capillari, soprattutto, ne deriva difficoltà a riparare lesioni e ferite), la vitamina C è infatti un riducente, mantiene attiva la prolil-idrossilasi. L’idrossilisina lega il galattosio o il glucosio. Sono tutte modifiche post-traduzion

 

Non tutte le proteine sono fatte solo da aminoacidi, ma alcune hanno gruppi prostetici, come per esempio la mioglobina o l’emoglobina che presentano entrambe un gruppo EME, le lipoproteine, necessarie a trasportare nella corrente del sangue, che è un liquido, il materiale lipidico come i triacilgliceroli, che sono quasi completamente idrofobici, e le glicoproteine in cui la parte non proteica è costituita da glucidi.

 

Come avviene la sintesi del collageno?

L’mRNA porta l’informazione per la sintesi del collageno, questo mRNA dalla parte dell’N-aminico ha una SEQUENZA SEGNALE che lo indirizza a un determinato ribosoma per fare la sintesi del collageno, il collageno ancor prima di staccarsi dal ribosoma entra nel RER (reticolo endoplasmatico rugoso) ed una volta entrato viene eliminata la sequenza segnale, e ha inizio l’idrossilazione. Nel RER il pre-procollageno matura, e dopo essere stato idrossilato viene anche glicosilato con glucosio o galattosio o entrambi. Poi passa nel Golgi dove si formano catene polipeptidiche che favoriscono l’avvolgimento e quindi la formazione della PROTEINA α (un altro precursore del collageno). Nel Golgi poi si formano alle estremità 2 catene peptidiche accessorie che all’estremità carbossilica sono unite da legami disolfuro (-S-S-). Dopo di che si formano vescicole che aprono un pertugio nella membrana plasmatica ed escono nel citoplasma questi precursori del collageno. Nel citosol vengono tagliati i peptidi e rimane la molecola a 3 filamenti del collageno. Queste molecole si uniscono poi spontaneamente a formare FIBRILLE di collageno.

Ci sono poi altri processi enzimatici, ad esempio quello dell’enzima lisil-ossidasi che ossida la lisina e da questa lisina ossidata, che in pratica è un aldeide, si ha la possibilità di formare LEGAMI CROCIATI. Il peptide C-terminale e il peptide N-terminale vengono tagliati nel citosol. La fibra del collageno è formata dalla disposizione non allineata delle molecole del tropocollageno, che si allineano con uno sfalsamento di circa ¼ di una molecola rispetto a quella affiancata. La molecola di collageno una volta rilasciata nel citosol è soggetta a reazioni enzimatiche: tra queste la lisin-ossidasi forma derivati aldeidici che si uniscono in legami covalenti crociati, indispensabili per la resistenza e compattezza alla trazione del collageno.

 

L’assunzione della CONFORMAZIONE NATIVA delle molecole proteiche neonate è necessaria al funzionamento corretto della proteina, esistono processi che distruggono la conformazione nativa della proteina, si parla della DENATURAZIONE DELLA PROTEINA. La proteina denaturata non è stata spezzettata in seguito al taglio del legame carbonilico, il legame carbonilico rimane intatto. La denaturazione, invece, consiste nella perdita della conformazione, che dipende dai legami deboli (legami a H, interazioni idrofobiche, interazioni elettrostatiche di gruppi con carica opposta). La proteina denaturata in alcuni casi si può rinaturare, ma solo nella minoranza dei casi. Nella maggior parte dei casi la proteina una volta denaturata, anche sottoponendola a condizioni che assomigliano allo stato nativo, non può essere rinaturata. Perché?

Una proteina denaturata non può riassumere la conformazione nativa perché la proteina esce amminoacido per amminoacido dal processo di sintesi, si allunga man mano che ogni amminoacido viene rilasciato dal sistema polinomiale, in questo modo gli ultimi amminoacidi che vengono rilasciati non sono in contatto con i primi usciti. Se la catena polipeptidica fosse rilasciata tutta in un colpo solo, tutti gli amminoacidi potrebbero nello stesso momento reagire tra di loro e si avrebbe una determinata conformazione, invece, i primi amminoacidi che escono hanno il tempo di reagire con i più vicini, prima che gli ultimi amminoacidi siano usciti. Un altro concetto molto importante nell’impossibilità di rinaturazione della maggior parte dei casi è il fatto che le proteine vengono guidate nell’assunzione della conformazione nativa. Non tutte le proteine si ripiegano spontaneamente appena vengono sintetizzate all’interno della cellula. Le proteine iniziano a ripiegarsi non appena inizia il processo di sintesi sui ribosomi, tuttavia le proteine possono essere assistite nel processo di ripiegamento, da una famiglia di proteine coadiuvanti, note come

 

Chaperoni Molecolari

Tra questi chaperoni importante è il Hsp70 (heat shock protein, da shock termico). I chaperoni sono proteine che legano le catene polipeptidiche nascenti, con funzione di guida e protezione. Gli chaperoni sono proteine che hanno il ruolo di consentire il corretto avvolgimento del filamento polipeptidico. Il filamento che esce man mano dal polisoma si arrotola intorno alla Hsp70, dopo di che ci sono molti altri passaggi (in parte conosciuti), poi ci sono degli chaperoni dove vanno a fluire queste proteine in formazione e dove c’è una specie di “stampo” che aiuta la proteina ad assumere la sua conformazione nativa. Se la proteina non assume la sua conformazione nativa non funziona. La questione del ripiegamento delle proteine neosintetizzate è molto importante perché ci sono patologie legate al mal ripiegamento delle catene polipeptidiche. Gli chaperoni legandosi a segmenti ricchi di amminoacidi idrofobici, forniscono la formazione dei legami che determinano la struttura secondaria della proteina nascente, successivamente inducono i ripiegamenti della struttura terziaria della proteina neoformata.

 

Chapero-Assisted Protein Folding

Questo processo avviene attraverso cicli successivi in cui la proteina nascente viene accomodata in una nicchia costituita dalle molecole di chaperons, quindi rilasciata e di nuovo avvolta, il processo richiede il consumo di ATP, cioè di energia. Una classe di patologie conseguente a uno scorretto ripiegamento della proteina è l’amiloidosi.