Respirazione Cellulare III e Fosforillazione Ossidativa II

Il complesso V

Il complesso FO-F1 utilizza il flusso di protoni per sintetizzare ATP.
I protoni si sono distribuiti in seguito alle reazioni di ossidoriduzione e vanno ad accumularsi nello spazio intermembrana, l’accumulo è consentito dalla condizione microanatomica di impermeabilità della membrana mitocondriale interna (utilizzando un micro-pHmetro possiamo dimostrare sperimentalmente questo accumulo). Il flusso di elettroni si dirige verso l’O2, poiché il potenziale redox impone quella direzione. I protoni sono comunque portati a rientrare nella matrice, attraverso il complesso, per regolarizzare il livello di cariche positive, cioè secondo il gradiente protonico, tentando di ristabilire una situazione d’equilibrio. essi possono rientrare, premendo, e trovano dei canali nel complesso V che consente di tornare nella matrice.

Queste cariche positive sono dotate di energia potenziale, la quale verrà rilasciata dalle stesse attraverso il passaggio nel complesso V: l’energia potenziale sarà quindi “intrappolata” nelle molecole di ATP. L’ATP sintetizzato viene poi distribuito dal suo punto d’origine, la matrice mitocondriale, ad ogni punto della cellula attraverso appositi meccanismi di trasporto.

 

La catalisi rotazionale

Il meccanismo si sviluppa partendo dall’accumulo dei protoni nello spazio tra la membrana interna ed esterna del mitocondrio a livello del canale d’entrata nel complesso FO-F1.

Il flusso di protoni attraverso il complesso fornisce l’energia per la rotazione dell’anello c, che è solidale con le subunità e e g, questa rotazione di 120° comporta delle modifiche conformazionali nei siti dei legame dei nucleotidi che si trovano nelle subunità ab (i siti di legame sono in particolare nella subunità b.

Ciascuna delle subunità si può modificare assumendo tre condizioni conformazionali diverse:

  • legame fosfato e ADP
  • sintesi di ATP
  • rilascio di ATP

Questo avviene contestualmente in tutte e tre le subunità, con una sfasatura di 120° che garantisce la contemporanea presenza di ogni condizione conformazionale. La catalisi rotazionale è in definitiva un effetto meccanico sulle molecole che determina un attività catalitica. Ogni rotazione completa fornisce, quindi, 3 molecole di ATP.

Una precisazione rispetto l’energia fornita dai protoni: questa non è utilizzata per la sintesi di ATP, ma per il suo rilascio.

 

Distribuzione dell’ATP nella cellula

La membrana deve gestire l’uscita di ATP neosintetizzato e l’ingresso di ADP nella matrice (dove servirà da substrato per la formazione di ATP). L’ATP risulta essere una molecola carica (-2)*, dunque non può passare direttamente attraverso la membrana, ma lo fa per mezzo di un antiporto, la traslocasi dei nucleotidi adeninici, con un contemporaneo passaggio di ADP3- citosolico verso l’interno e ATP4- mitocondriale verso l’esterno. La forza motrice del trasporto di antiporto è il gradiente elettrochimico: una carica negativa esce dall’ambiente in cui prevalgono cariche negative.

Per sintentizzare ATP è necessario anche Pi (HPO42- oppure H2PO4), che viene trasportato all’interno della matrice grazie all’energia potenziale del gradiente protonico (la sintesi di ATP impiega solo il 90% di questa energia): attraverso un simporto assieme ad un protone H+. Il costo energetico si traduce nell’afflusso di 4 protoni all’interno della membrana (uno per il Pi e tre per ADP, che entrano attraverso il complesso V).

 

Inibitori

  • Il cianuro e il monossido di carbonio (che ha anche una maggiore affinità per l’O2 rispetto all’emoglobina) inibiscono la citocromo c ossidasi (nell’ultima tappa della catena respiratoria)
  • L’antimicina A che blocca il trasferimento di elettroni dal citocromo b al citocromo c1 nella via verso il citocromo c
  • Il rotenone, un insetticida abbastanza noto, impedisce il trasferimento di elettroni dal centro Fe-S del complesso I all’ubichinone
  • L’oligomcina e la venturicidina inibiscono il quinto complesso
  • Termogenina
  • Azide

 

Disaccoppianti

Esistono molecole come il DNP in grado di disaccoppiare la fosforilazione dall’ossidazione, fanno avvenire il consumo di O2 anche se non si verifica la sintesi di ATP: queste molecole sono chiamate disaccoppianti. Il DNP si produce durante la lavorazione della dinamite e se assunto dall’organismo umano causa un rapida perdita di peso, cataratta, cecità e anche morte. Fino agli ’30 era un prodotto da banco per la perdita di peso, poi il composto è stato dichiarato illegale per uso personale, ma continua ad essere utilizzato nell’industria per la conservazione dei materiali in quanto il DNP si dimostra essere un ottimo batterio/funghicida. Questo perché il composto causa nelle cellule una forte consumo di O2 con dispersione di energia sotto forma di calore, e sia l’elevata temperatura che l’assenza della sintesi di ATP provoca la degenerazione delle cellule stesse.


La separazione dei processi, dovuta all’azione dei disaccoppianti, è garantita se i protoni riescono a rientrare nella matrice, ma non attraverso il complesso V. Diventa necessario creare dei “buchi” nella membrana per consentire il passaggio alle cariche positive. Il DNP è un acido debole: ha quindi la possibilità accettare o rilasciare protoni in base al pH dell’ambiente ed essendo liposolubile è in grado di passare attraverso la membrana mitocondriale interna, anche solo seguendo il gradiente di concentrazione. Quando è in ambiente intermembrana lega a sé i protoni, poi passando la membrana ed entrando nella matrice è in grado di dissociare, poiché si viene a trovare in un ambiente con pH minore, e nella forma dissociata può ritornare nello spazio tra le due membrane.

Il dinitrofenolo è un disaccoppiante non naturale, ne esistono però altri prodotti dalla cellula stessa e noti con la sigla UCP (uncoupling protein), se ne conoscono 7-8, ad esempio la termogenina.

La termogenina (ora chiamata UCP1) fa rientrare i protoni senza la sintesi di ATP, e l’energia viene convertita in calore. L’attività dell’UCP1 dipende dalla disponibilità di acidi grassi: questo carburante viene quindi usato soprattutto per sviluppare calore. I disaccoppianti sono composti utili nel caso di animali soggetti a letargo o in generale sfruttati, anche nell’uomo, per la regolazione della temperatura corporea: questo processo è tipico del grasso bruno, dove gli adipociti sono ricchi di mitocondri disaccoppiati. L’alternativa ai mitocondri disaccoppiati, per scaldarsi, sono i brividi.

L’ipotalamo raccoglie il segnale del freddo: partono i nervi del simpatico, i quali innervano le cellule adipose brune. Il mediatore è la norepinefrina, il cui recettore è di quelli che attivano il cAMP come secondo messaggero (ci sarà la proteina G), il messaggero attiva la proteina cinasi A, di cui è substrato la triacilglicerolo lipasi, che mobilizza le riserve di triacilglicerolo. Questi enzimi sono fosfoenzimi, e sono attivati solo se fosforilati in modo cAMP-dipendente, la via dell’cAMP è quella del glucagone, ed è logico che oltre a mobilizzare il glicogeno il glucagone mobilizzi anche i triacilgliceroli delle riserve lipidiche.

L’ amital inibisce il complesso I, quindi il consumo di O2 da parte dei mitocondri durante l’ossidazione dei substrati che generano NADH, qui il flusso di elettroni si interrompe ma può essere ripreso somministrando il succinato del complesso II, quindi continua il flusso sull’ubichinone. Per far partire il processo della respirazione si parte con malato (carburante) e Pi, e appena aggiunto l’ATP parte il consumo di O2, fino a quando c’è ATP da fosforilare.

L’antimicina A blocca il flusso di elettroni a livello del complesso III, l’ascorbato è un agente riducente che può fornire elettroni, facendo partire l’ultimo pezzo di catena respiratoria. Il succinato non fa nulla perché è prima del blocco dell’antimicina A, mentre con l’ascorbato riprende il consumo di ossigeno fino all’esaurimento di ATP.

Azide, CO e cianuro agiscono a livello del complesso IV e non c’è modo di impedire il loro effetto. L’oligomicina impedisce il consumo di O2 nei mitocondri normali, il DNP, tuttavia, ripristina il consumo di O2 poiché dissipa il gradiente protonico.

 

L’ultima tappa della fosforilazione ossidativa

Nella catena respiratoria c’è un flusso di elettroni, che fluiscono verso l’ossigeno e lo riducono, inducendolo a formare acqua. Durante questo ciclo di reazioni si incontrano alcuni ROS (Reactive Oxygen Species) come ioni superossido e radicali idrossilici.

Entrambi sono dei radicali, cioè molecole con un elettrone spaiato altamente reattivo in un orbitale esterno che può innescare una catena di reazioni rimuovendo un elettrone da un’altra molecola per completare il suo orbitale.

  1. O2 + e O2
    Il primo passo dell’ultima fase della fosforilazione ossidativa inizia quando un elettrone si lega ad una molecola di ossigeno, formando lo anione superossido (O2). Questo radicale è molto pericoloso in quanto tenderebbe a strappare elettroni a molecole circostanti, per questo la reazione avviene solo quando l’O2 è all’interno del complesso 4, che non permette la sua fuoriuscita.
  1. O2 + e + 2H+ H2O2
    Ora lo anione superossido reagisce con un elettrone e due protoni/H+ per formare perossido di idrogeno, detto anche acqua ossigenata.
    L’acqua ossigenata di per sé non sarebbe un radicale ma, con due reazioni scoperte da Fenton e Haber-Weiss, in presenza di ioni Fe2+ può scindersi e dare OH e OH (quindi formare un radicale idrossilico).
  1. H2O2 + e + H+ H2O + OH*
    Quando il perossido reagisce con un altro elettrone e un altro protone, formando acqua e un radicale idrossilico (OH*) che ha l’elettrone che ha occupato gli orbitali più esterni. Questo è il radicale più pericoloso, attacca le macromolecole come DNA e proteine.
  1. OH* + e + H+ H2O
    Il radicale idrossilico viene fatto reagire con un elettrone e un protone per formare acqua, rendendo inoffensiva questa pericolosa molecola.

 

I processi ossidativi nella cellula risultano nel trasferimento di elettroni all’ossigeno per formare H2O senza il rilascio di intermedi (o leakages). Purtroppo si può formare anione superossido a causa del trasferimento di un elettrone dal semichinone (prodotto dall’ubichinone dai complessi I e II) all’ossigeno.

Sono perciò presenti nella cellula degli enzimi che neutralizzano questi ioni superossido.

L’enzima superossido dismutasi catalizza la trasformazione dell’anione superossido in perossido di idrogeno, che poi verrà trasformata dall’enzima catalasi in acqua e ossigeno.

Un altro sistema per neutralizzare l’H2O2 coinvolge il glutatione, detto anche g-glutammilcisteinilglicina. La cisteina è quella che gli conferisce il gruppo tiolico SH, che può quindi reagire con un’altra molecola di glutatione e formare un ponte disolfuro tra le due. Questo permette al glutatione di passare dalla forma ossidata a quella ridotta con facilità, come l’acido lipoico. Quindi il glutatione permette ad un enzima chiamato glutatione perossidasi che riduce il perossido di idrogeno ad acqua utilizzando i due idrogeni liberati quando si ossida (formando il legame disolfuro) il glutatione.

Perché questa reazione possa sempre avvenire è necessario che il glutatione ossidato venga ridotto dall’enzima glutatione reduttasi che utilizza un NADPH + H+. Il glutatione è una molecola molto importante in molti processi, ad esempio per la stabilità dei globuli rossi o nella via dei pentosi (via alternativa alla glicolisi che consiste nella ossidazione del glucosio-6-fosfato che porta alla formazione di ribosio e NADPH + H+).

 

* Ricordiamo che l’ATP agisce sempre legato a un Mg2+: due delle sue quattro cariche negative vengono quindi neutralizzate