Respirazione Cellulare II e Fosforillazione Ossidativa I

Regolazione del ciclo dell’acido citrico 

  • Alti livelli di ATP o NADH (prodotti) inibiscono la citrato sintasi (tappa irreversibile), quindi in condizioni di alto carico energetico.
  • ADP e NAD+ (basso carico energetico) attivano la isocitrato deidrogenasi, che produce l’α-chetoglutarato (il quale è in equilibrio con il glutammato, può uscire dal ciclo di Krebs e formare questo aminoacido). Cosi il glutammato può essere transaminato (da una transaminasi) e formare l’α-chetoglutarato.
  • Un basso livello di ATP (o alto livello di ADP) e un alto livello CoA accelerano il ciclo di Krebs per fornire energia alla cellula.


Inoltre ci sono 3 enzimi regolatori

  • Citrato sintasi = ATP, NADH e succinilCoA inibiscono la reazione, siamo in condizioni di       alto carico energetico. Questo processo evita lo spreco di materiale. Inoltre il citrato       prodotto inibisce la prima tappa, ma non è una modulazione di importanza fondamentale.
  • Isocitrato deidrogenasi = inibita dall’ATP e NADH e attivata da ADP e NAD+. Il rapporto NAD+/NADH è fondamentale per la regolazione dei processi: più alto è il rapporto e maggiore è l’effetto di attivazione.
  • α-chetoglutarato deidrogenasi = NADH e succinil CoA inibiscono il processo (alto carico energetico), che è invece attivato da AMP. Questo enzima è quasi uguale alla piruvato deidrogenasi, ma non è regolato covalentemente.

L’aumento della concentrazione del succinilCoA, prodotto del complesso enzimatico a-chetoglutarato deidrogenasi, causa una inibizione competitiva dalla citrato sintasi che agisce sull’ acetilCoA, e questo perché il succinilCoA assomiglia all’ acetilCoA. Inoltre inibisce la reazione che da a-chetoglutarato produce succinilCoA.

Anche la piruvato deidrogenasi ha una funzione regolatrice: ATP, NADH e AcetilCoA la inibiscono, NAD+ e CoA la attivano. Quindi l’acetilCoA inibisce la propria produzione.

Il ciclo di Krebs è detto anfibolico, perché è sia anabolico che catabolico. A partire da intermedi del ciclo possiamo iniziare processi biosintetici di varia natura. Per esempio dall’ acetil-CoA si possono ottenere acidi grassi, dal succinil-CoA si ottengono le porfirine. Oppure, nel caso del glutammato, si può ottenere un intermedio del ciclo di Krebs, ovvero l’α-chetoglutarato. Il Ca++ ha ruoli importanti nella modulazione: infatti favorisce la reazione che da a-chetoglutarato porta a succinil-CoA. Infatti lo stimolo alla contrazione muscolare prevede un aumento del calcio, quindi è opportuno, aumentando l’attività muscolare, che aumentino le disponibilità di energia, cioè i processi energetici.

Vi sono poi delle osservazioni che possono essere fatte su meccanismi ancora non del tutto chiariti. Considerando il processo di liponeogenesi, ovvero la sintesi di triacilgliceroli (acidi grassi) che avviene nelle cellule del fegato, si è visto come l’insulina favorisca negli adipociti l’attività della piruvato deidrogenasi e la conseguente produzione di AcetilCoA che può essere utilizzato come precursore nella sintesi degli acidi grassi, che vengono successivamente accumulati con funzione di riserva nelle cellule del tessuto adiposo. La stessa azione stimolatrice dell’insulina è svolta dalle catecolamine nei cardiomiociti, e ciò può essere comprovato dalla presenza di goccioline lipidiche nelle cellule del cuore pronte per essere utilizzate come fonte di energia per la contrazione del miocardio, senza dover attendere la mobilitazione dei lipidi dagli adipociti. Nell’ambito della regolazione covalente della piruvato deidrogenasi, si può osservare come la distribuzione intracellulare del calcio influisca sulla sua attività. Infatti esso può stimolare l’azione di una proteina fosfatasi regolatrice associata al complesso E1 che defosforilando la piruvato deidrogenasi la rende così più attiva. Vi è poi una seconda proteina regolatrice associata anch’essa al complesso E1, una cinasi che, fosforilando la pirvato deidrogenasi, svolge una funzione antagonista alla fosfatasi precedente.

 

Considerazioni sulla regolazione del ciclo dell’acido citrico 

Nel ciclo di Krebs si distinguono tre reazioni irreversibili dette anche regolatrici:

  • Citrato Sintasi: AcetilCoA + Ossalacetato à Citrato
  • Isocitrato Deidrogenasi: Isocitrato à α-Chetoglutarato (si libera la prima molecola di CO2 e la prima di NADH)
  • Complesso α-Chetoglutarato Deidrogenasi: α-chetoglutarato à Succinil-CoA (complesso simile a quello della piruvato deidrogenasi, si libera la seconda e ultima molecola di CO2 e la seconda di NADH)

 

 

Fosforillazione Ossidativa 

La fosforilazione ossidativa rappresenta il culmine del metabolismo energetico negli organismi aerobici. Tale processo negli eucarioti avviene all’interno dei mitocondri, e specificatamente si ha un flusso di elettroni provenienti dalle molecole di cofattori quali NADH, FADH2 (formatisi durante le reazioni di glicolisi, β-ossidazione degli acidi grassi, ciclo di Krebs) che viene incanalato attraverso trasportatori, che non sono altro che proteine, inserite a livello della membrana interna mitocondriale, contenenti gruppi prostetici in grado di accettare o donare uno o due elettroni.

Lungo questa “catena di trasporto degli elettroni” avvengono delle reazioni di ossido-riduzione e l’energia che è rilasciata dagli elettroni coinvolti è immediatamente utilizzata per pompare protoni (H+) dalla matrice mitocondriale allo spazio intermembrana. L’azione di queste pompe protoniche, unite al fatto che la membrana interna del mitocondrio è impermeabile alla maggior parte delle piccole molecole, agli ioni e quindi anche ai protoni, darà luogo alla formazione di un gradiente di concentrazione protonico sulla stessa membrana interna che verrà utilizzato da uno specifico complesso enzimatico (ATP sintasi) per produrre energia sotto forma di molecole di ATP.

E’ importante inoltre ricordare che l’accettore finale degli elettroni che scorrono lungo questa catena è la molecola di ossigeno, che riducendosi formerà molecole di H2O.

 

Catena di trasporto degli elettroni nella fosforilazione ossidativa

La catena di trasportatori presente sulla matrice mitocondriale interna è formata da diversi complessi enzimatici contenenti cofattori, coenzimi, proteine Fe-S e gruppi prostetici, tutti necessari per le reazioni redox, e sono i seguenti:


Complesso I (NADH-ubichinone ossidoreduttasi)

E’ quello strutturalmente più complicato di tutti, costituito da 42 catene polipeptidiche. Questo trasferisce i suoi elettroni all’ubichinone (detto anche Coenzima Q) che è in grado di accettare fino a due elettroni.
Questo complesso catalizza due reazioni:

  • Trasferimento esoergonico di uno ione idruro dal NADH e di un H+ dal solvente acquoso della matrice: NADH + H+ + Q à NAD+ + QH2
  • Trasferimento endoergonico di 4 H+ dalla matrice allo spazio intermembrana attraverso una pompa protonica guidata dall’energia derivata dal trasferimento degli elettroni.

Gli elettroni che provengono dal NADH non arrivano però direttamente all’ubichinone, ma riducono inizialmente un FMN (flavin mononucleotide), che assieme al FAD deriva dalla vitamina B2 o riboflavina. Esso è in grado di accettare due protoni sul suo anello isoallossazinico e, cosa ancora più importante, è in grado di legare e donare un elettrone per volta all’accettore successivo (che è una proteina Fe-S) attraverso la sua forma semichinonica stabile. Il centro Fe-S infatti è in grado di accettare solo un elettrone per volta, ed è per questo che la forma semichinonica dell’FMN risulta così utile.
Esistono diversi tipi di proteine Fe-S con un numero differente di atomi di Fe e S nel loro sito attivo di legame.
E’ comunque l’atomo di Ferro a giocare un ruolo fondamentale, in quanto nella forma ossidata Fe3+ lega un elettrone riducendosi a Fe2+, e successivamente rilascia l’elettrone all’accettore seguente ritornando alla sua forma ossidata, pronto per ripetere un altro ciclo.schema1

Il coenzima Q (o ubichinone) è un benzochinone con una catena laterale isoprenoide idrofobica. Date le sue ridotte dimensioni e la sua idrofobicità, esso si trova a “galleggiare” nel doppio strato lipidico della membrana interna del mitocondrio.
Come accade per l’FMN, anche il coenzima Q possiede una forma semichinonica capace di accettare un solo elettrone alla volta dal complesso Fe-S, legando un secondo elettrone diventerà ubichinolo (forma ridotta).

Complesso II (succinato-ubichinone ossidoreduttasi)
Questo complesso fa parte del ciclo di Krebs (dove prende il nome di succinato deidrogenasi), ed è l’unico enzima del ciclo dell’acido citrico ad essere legato alla membrana mitocondriale interna.
Al suo interno, legato covalentemente, questo complesso possiede un FAD che riceve gli elettroni dal succinato per poi trasferirli ad un altro centro Fe-S. Anche qui gli elettroni dal centro Fe-S andranno poi sull’ubichinone.

Complesso III (ubichinone-citocromo c ossidoreduttasi)
La funzione di questo complesso enzimatico è quello di accoppiare il trasferimento degli elettroni dall’ubichinolo (coenzima Q ridotto) al citocromo c con il trasporto di protoni dalla matrice mitocondriale nello spazio intermembrana. Al suo interno possiamo individuare un centro Fe-S (del tipo 2Fe-2S) e tre differenti gruppi prostetici EME (EME BH, EME BL ed EME C1), quindi questo complesso possiede due tipi differenti di citocromi, un tipo B (con i due gruppi EME BH e BL) e uno C (con il gruppo EME C1).
Esistono tre differenti tipi di citocromi, A, B e C, denominati in questo modo a seconda del differente spettro di assorbimento. Il più comune è quello di tipo B (Ferro Protoporfirina IX) che è anche presente nella mioglobina e nell’emoglobina. Il citocromo A differisce dal B per la presenza nell’ EME di un formile (CHO) al posto di un metile (CH3), e una lunga catena isoprenoide. Infine abbiamo il citocromo C in cui l’atomo di ferro dell’EME con i suoi due legami di coordinazione non impegnati con i quattro nuclei pirrolici, lega due residui aminoacidici della proteina (istidina e metionina), inoltre le due catene viniliche (CH=CH2) si legano a due residui di cisteina contribuendo alla stabilità di legame del citocromo con la proteina. Questo citocromo è quello posizionato più superficialmente nel complesso e per questo più facilmente isolabile per essere studiato. 

Complesso IV (citocromo c ossidasi)
Questo complesso è l’ultimo della catena di trasporto degli elettroni e catalizza la riduzione dell’ossigeno molecolare ad H2O attraverso l’ossidazione del citocromo c ridotto proveniente dal complesso III. Anche qui vi sono due citocromi A e A3 e due ioni rame complessati con gruppi –SH di due residui di cisteina. Il trasferimento degli elettroni procede dal citocromo c al centro CuA, al gruppo EME A, al centro A3-CuB e infine all’ossigeno. E’ utile osservare come il potenziale redox01) dell’ultima “mezza reazione” (1/2 O2 + 2H+ + 2e à H2O) sia quello con valore positivo più grande di tutti gli altri (+ 0,816) e ciò indica la direzione spontanea del flusso di elettroni.

 

Considerazioni sul NADH e FADH2 nella fosforilazione ossidativa
Abbiamo visto come una molecola di NADH nella matrice mitocondriale trasferisca i suoi elettroni ossidandosi al complesso I della catena di trasporto degli elettroni. Questo NADH può essere di differente provenienza. Nello specifico:

  • Nella glicolisi: gliceraldeide 3- fosfato deidrogenasi / Piruvato deidrogenasi
  • Nel ciclo di Krebs: isocitrato deidrogenasi / complesso dell’α-chetoglutarato deidrogenasi / malato deidrogenasi
  • Nella β-ossidazione degli acidi grassi

Inoltre consideriamo anche la produzione di FADH2 per opera della succinato deidrogenasi (complesso II) e anche nella degradazione degli acidi grassi (β-ossidazione).

 

Riassumendo: gli elettroni dal NADH sono trasferiti attraverso il complesso I all’ubichinone (che si riduce a ubichinolo), questo processo è obbligatoriamente accoppiato all’espulsione di 4 H+ da parte del complesso I. Successivamente gli elettroni passano al complesso III dove vanno a ridurre il citocromo c con conseguente espulsione di altri 4 H+ nello spazio intermembrana. Il citocromo c viene poi trasferito al complesso IV dove si ossida cedendo i suoi elettroni all’ossigeno molecolare che si riduce ad H2O, espellendo infine altri 2 H+. Il complesso II è l’unico della catena di trasporto degli elettroni a non possedere abbastanza energia per poter espellere protoni nello spazio intermembrana, nonostante su di esso avvenga l’ossidazione del succinato a fumarato e il trasferimento degli e su un FAD. Infine vi è un quinto complesso (che verrà descritto meglio successivamente), quello dell’ATP sintasi o complesso Fo-F1 (la “o” sta ad indicare la sensibilità di questo complesso per l’antibiotico oligomicina). Esso sfrutta la formazione del gradiente di concentrazione protonico formatosi con l’espulsione degli H+. I protoni rientrano nella matrice del mitocondrio grazie al canale formato dal complesso dell’ATP sintasi e utilizzati per produrre ATP con un meccanismo molto fine.

 

Altre modalità di trasferimento di elettroni all’ubichinone

Al coenzima Q possono giungere elettroni non solamente dal complesso I e II ma anche da altre vie:

Una per esempio è quello che si ritrova nella degradazione degli acidi grassi (che avviene anch’essa nel mitocondrio). La prima tappa della β-ossidazione è catalizzata dalla flavoproteina acil-CoA deidrogenasi che trasferisce due elettroni dal substrato al FAD della deidrogenasi stessa, poi la flavoproteina trasferisce gli elettroni al complesso ETF (electron transfer flavoprotein) e infine alla ETF-ubichinone ossidoreduttasi che attraverso un centro ferro-zolfo cede gli elettroni alla catena respiratoria riducendo l’ubichinone.

Una seconda modalità è rappresentata dai sistemi navetta (shuttle). La NADH deidrogenasi del complesso I accetta solo elettroni provenienti da NADH presente nella matrice mitocondriale, e dato che la membrana interna del mitocondrio è impermeabile anche agli elettroni riducenti del NADH citosolico, che per esempio proviene dal processo della glicolisi (nello specifico dall’enzima glicolitico gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi), vengono trasferiti nella matrice tramite questi sistemi navetta.

 

Uno di questi sistemi è rappresentato dallo shuttle del glicerolo 3-fosfato.

Nel citosol cellulare sono presenti dal processo di glicolisi il diidrossiacetonefosfato e NADH. L’enzima citosolico glicerolo 3-fosfato deidrogenasi utilizzando questi substrati catalizza la reazione che dà origine a glicerolo 3-fosfato e NAD+. Così si può riossidare il NADH proveniente dalla glicolisi. Successivamente l’enzima mitocondriale glicerolo 3-fosfato deidrogenasi, che è in parte inserito nella membrana interna del mitocondrio, trasferisce gli elettroni provenienti dal NADH citosolico, che sono passati al glicerolo 3-fosfato nella precedente reazione, al FAD che si riduce a FADH2. Infine gli elettroni dal FADH2 passano al coenzima Q per poi contribuire alla formazione di molecole di ATP tramite la catena respiratoria.

N.B. Da studi recenti si è stabilito che l’ossidazione di una mole di FADH2 è in grado di dare origine a 1,5 moli di ATP. Per quanto riguarda invece l’ossidazione del NADH citosolico, utilizzando lo shuttle del glicerolo 3-fosfato si ottengono 1,5 moli di ATP, mentre utilizzando un altro shuttle (quello del malato-aspartato) se ne possono ottenere 2,5.

 

La fosforilazione ossidativa consiste in due processi:

  1. l’ossidazione dei coenzimi ridotti nel metabolismo intermedio, dove si sono formati i portatori di elettroni ad alta energia che scendono lungo la catena respiratoria (i trasportatori hanno dei valori redox che li portano ad essere più affini agli elettroni delle coppie redox precedenti e la coppia ossigeno-acqua ha maggior affinità)
  2. la sintesi di ATP

Gli elettroni rilasciano poco alla volta buona parte dell’energia che contengono, questa viene utilizzata per prelevare protoni dalla matrice mitocondriale e buttarli all’esterno, ciò avviene

  • nel complesso 1: nel passaggio da NADH ad ubichinone
  • nel complesso 3: nel passaggio da ubichinone ridotto a citocromo c: quest’ultimo è legato covalentemente a un atomo di ferro, questo atomo di ferro quando è trivalente è in grado di accettare un elettrone diventando bivalente e la stessa cosa avviene per i complessi ferro-zolfo
  • nel complesso 4: nell’ossidazione del citocromo c
  • L’ossidazione del succinato a fumarato non rilascia abbastanza energia per espellere elettroni

Al momento non si conoscono i meccanismi con cui il complesso 1 espelle protoni e quanti protoni espella esattamente ogni complesso: alcuni testi dicono 10, altri 12.

Una volta formato il gradiente protonico, gli H+ premono sulla membrana tentando di inseguire il gradiente chimico e il potenziale elettrico, ma non entrano se non attraverso i complessi 5, che sono migliaia nel mitocondrio. Il complesso 5 (ATP sintetasi) è formato da due subunità principali:

  • il complesso FO , il canale attraverso cui passano i protoni
  • il complesso F1, sede dell’attività enzimatica che catalizza la reazione ADP+Pi ↔ATP.

COMPLESSO 3: catalizza il trasferimento di elettroni dall’ubichinone al citocromo c che li lega uno alla volta. Qui si trova il ciclo dell’ubichinone che fa sì che avvenga il passaggio di un elettrone per volta al citocromo.

COMPLESSO 4: formato da 13 subunità, l’enzima citocromo c ossidasi ossida il citocromo c e, ogni volta che 4 elettroni attraversano questo complesso, l’enzima preleva 4 ioni H+ dalla matrice per convertire l’O2 in 2 molecole di H2O.

COMPLESSO 5: FO è il poro protonico e F1 è il motore protonico, formato dall’enzima ATP-sintetasi. La componente FO è costituita da subunità c (in numero da 10 a 14) che costituiscono un anello, la componente a si trova adesa all’anello, il quale viene fatto ruotare in senso antiorario dal flusso di protoni, nella matrice F1 l’anello è costituito da 3 subunità α-β e l’attività catalitica risiede esclusivamente nelle subunità β. La rotazione dell’anello coinvolge anche le subunità γ ed ε, le due subunità b svolgono il ruolo di tenere fermo il complesso α3 – β3. Le subunità γ ed ε ruotano con l’anello c, la rotazione comporta una modificazione conformazionale a livello del sito di legame nucleotidico sulle subunità α-β.

La prima conformazione del sito di legame è quella che lega ADP e Pi, con una rotazione di 120° della subunità γ si arriva ad una conformazione che produce ATP. La rotazione di altri 120° porta al rilascio dell’ATP, questo succede in tutte le subunità del complesso. La fase critica della catalisi rotazionale consiste nel rilascio dell’ATP: se diminuisce l’energia disponibile non cessa la sintesi, ma l’ATP non viene più rilasciato.

 

Bilancio energetico della glicolisi

Consideriamo una molecola di glucosio alle condizioni standard :

GLICOLISI 2 NADH 3/5 ATP (a seconda del sistema di trasporto degli elettroni)
    2 ATP
COMPLESSO DELLA PIRUVATO DEIDROGENASI 2 NADH 5 ATP
CICLO DI KREBS 6 NADH 15 ATP
  2 FADH2 3 ATP
    2 ATP (o GTP)
    TOT 30/32 ATP

 

Sistema navetta maltato-aspartato

E’un sistema che porta gli elettroni dal NADH citosolico al NADH mitocondriale

Le transaminasi catalizzano reazioni in cui si hanno un amminoacido e un a-chetoacido, che di solito è l’α-chetoglutarato, e che hanno bisogno della proteina B6 come cofattore. Questo enzima stacca il gruppo α-aminico dell’aminoacido che diventa il corrispettivo α-chetoacido (alanina-piruvato per esempio) e lo trasferisce sull’α-chetoacido che è accettore del gruppo aminico (α-chetoglutarrato-glutammato): questa reazione è importante perché in questo modo si possono avviare gli amminoacidi al loro metabolismo e, come in questo caso, serve affinché gli elettroni possano passare all’interno del mitocondrio per essere mandati alla catena respiratoria in quanto l’amminoacido può attraversare la membrana mitocondriale mentre l’α-chetoacido no (l’ossalacetato non può uscire dal mitocondrio ma se transaminato in aspartato sì). Inoltre la transaminazione ha come scopo quello di far uscire atomi di carbonio di una molecola.

schema2

La gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi produce NADH, catalizzando l’ossidazione da gliceraldeide 3-fosfato a 1,3-bisfosfoglicerato, questo NADH può essere riossidato da una malato deidrogenasi citoplasmatica. La reazione procede in questo senso grazie a una attiva produzione di NADH e utilizza come substrato l’ossalacetato, questa reazione è reversibile e termodinamicamente favorita. La membrana interna del mitocondrio possiede dei trasportatori antiporto che fanno entrare malato e fanno uscire α-chetoglutarato, intermedio del ciclo di Krebs, in equilibrio con glutammato. Nella matrice mitocondriale, la malato deidrogenasi mitocondriale ossida il malato trasferendo le coppie di elettroni al NAD+ e formando NADH + H+, il malato viene ridotto ad ossalacetato, che a sua volta è il substrato dell’aspartato amminotranferasi, la quale prende il gruppo aminico dal glutammato (che diventa α-chetoglutarrato) e produce aspartato. Questo ha un trasportatore antiporto intermembrana che lo scambia con un glutammato che gli permette di uscire dal mitocondrio. Se prodotto in quantità maggiore rispetto a quella presente nel citosol tende ad uscire facendo entrare quel glutammato che ha fornito il gruppo aminico all’ossalacetato per fare il malato. A questo punto troviamo l’aspartato nel citosol: qui l’aspartato amminotrasferasi citoplasmatica, che funziona in senso inverso rispetto a quella mitocondriale, catalizza il passaggio da aspartato ad ossalacetato e da α-chetoglutarrato a glutammato. La riossidazione del NADH che abbiamo portato nel mitosol produce 2,5 o 3 ATP.