Respirazione Cellulare I

La respirazione cellulare è molto più complessa della glicolisi, ma è anche molto più vantaggiosa energeticamente.
Inizia dal ciclo di Krebs, cioè dalla condensazione di OSSALACETATO con Acetil-CoA. Nella fosforilazione ossidativa, che inizia con la riossidazione del NADH, vedremo che il flusso di elettroni andrà dal NADH, tappa per tappa, con reazioni di ossidoriduzione successiva fino all’ossigeno, che mettono a disposizione l’energia contenuta in questi coenzimi per produrre ATP. L’ossigeno è l’accettore finale degli elettroni. La quantità di energia che si libera con la glicolisi anaerobia è il 5%, 146 KJ di energia si liberano dalla trasformazione di glucosio a piruvato o lattato, e 2840 KJ quando l’ossidazione del carburante glucidico va avanti fino in fondo.

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Il collegamento tra piruvato e fosforilazione, cioè il complesso piruvato-deidrogenasi è complicato, infatti prima vennero definite le tappe del ciclo di Krebs. La piruvato deidrogenasi è un complesso enzimatico molto complicato ed agisce nel mitocondrio. La decarbossilazione ossidativa del piruvato avviene nel mitocondrio, dove troviamo una TRASLOCASI che permette l’ingresso nella matrice mitocondriale di un piruvato accompagnato da un protone.

Bisogna ricordare che c’è competizione tra i vari substrati perché legano più enzimi (perché il substrato di un enzima è quasi sempre o sempre substrato di altri enzimi), ciò conferisce complessità a questi processi. Ad esempio il piruvato è anche il substrato della classe di enzimi che si misurano per le analisi del sangue, la ALT (alanina-transaminasi) e la AST. Il piruvato è in equlibrio con l’alanina che è un modulatore della glicolisi.

Al congiungimento tra glicolisi e ciclo di Krebs in cui si realizza la conversione del piruvato in Acetil-CoA, convergono anche gli amminoacidi, gli acidi grassi, l’etanolo, insomma l’acetil-CoA è il metabolita su cui convergono tutti i carburanti.

 

La piruvato deidrogenasi è un grosso complesso multienzimatico fatto da 3 enzimi e 5 coenzimi, alle cui origini vi sono tutte le vitamine idrosolubili. In tutto ci sono 60 subunità (probabilmente nell’Escherichia-Coli, nell’uomo dovrebbero essere di più). Con l’acetil-CoA si parte per il ciclo degli acidi tricarbossilici: l’ossalacetato si condensa con l’acetil-CoA. Nel ciclo di Krebs si ha l’ossidazione completa di questo acetato montato su una molecola di coenzima A. 2 atomi di carbonio vengono rilasciati sotto forma di CO2, di conseguenza non esiste più l’acetile ma si sono formate coppie di elettroni dagli intermedi che sono andate sui coenzimi (NADH e FADH2). Si formano 3 molecole di NADH più 3 di H+ oppure 1 molecola di FADH2, che lega 2 interi atomi di idrogeno e non un idruro come il NAD. (Alcune deidrogenasi utilizzano il NAD come trasportatore e altre il FAD, per questo si forma o l’uno o l’altro, non possono formarsi entrambi con la stessa deidrogenasi). Il significato di questi complessi enzimatici è il fatto che siano strutture vantaggiose perché i prodotti dei diversi enzimi sono substrati dell’enzima successivo, ma essendo fisicamente a contatto il loro prodotto viene passato direttamente senza dover essere rilasciato nell’ambiente cellulare, di conseguenza il processo è molto efficiente.

La reazione complessivamente: piruvato à coenzima A libero à NAD à complesso della piruvato-deidrogenasi: (3 coenzimi: TPP, lipoato, FAD)

TPP: tiamminapirofosfato, forma coenzimatica della vitamina B1

Lipoato o acido lipoico (da 10 tonnellate di fegato bovino per ottenere 30 mg di lipoato)

FAD: flavina adenina dinucleotide

Naturalmente i 3 coenzimi alla fine della reazione si ritrovano tali e quali, il NAD+ viene ridotto a NADH e il coenzima A si ritrova come Acetil-CoA
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L’acetil-CoA può essere prodotto sia da carburante glucidico che lipidico, la differenza è che dall’acetil-CoA non posso fare gluconeogenesi, cioè non posso utilizzare acidi grassi per ripristinare la glicemia, invece dall’acetil-CoA si parte per la lipogenesi. Ciò significa che con un eccesso di glucidi posso far ingrassare il paziente perché glucosio diventa acetil-CoA e poi acidi grassi.

La regolazione della glicolisi non deve essere inibita dall’alto carico energetico nel fegato, per questo l’evoluzione ha “inventato” il fruttosio-2,6-bisfosfato, per consentire il viaggio da glucosio ad acidi grassi e ad acilgliceroli che si verifica in condizioni di iperglicemia, di alto carico energetico. Queste sono le condizioni che richiedono che il glicogeno sia trasformato in un carburante più leggero, come sono i triacilgliceroli che non portano acqua a differenza del glicogeno che è ricco di gruppi polari. Se avvenisse il contrario una persona di 70 Kg peserebbe 170 Kg.

 

Complesso della piruvato deidrogenasi

3 enzimi: E1 o piruvato deidrogenasi, E2 o diidrolipoiltransacetilasi, E3 o diidrolipoildeidrogenasi.

  • L’E1 ha come coenzima il TPP
  • L’E2 ha come coenzima l’acido lipoico e l’acetil-CoA come prodotto finale
  • L’E3 ha come coenzima il FAD

NB: normalmente il NAD è in soluzione nell’ambiente dove agisce l’enzima, quindi incontrerà l’enzima diffondendo, mentre il FAD è quasi sempre legato covalentemente all’enzima.

Il piruvato si lega alla TPP sottoforma di gruppo idrossietilico, quindi perde CO2 (decarbossilazione) e si riduce, poi per effetto del secondo enzima si ossida diventando un gruppo acetile, trasferito sull’acido lipoico, che ridotto dona protoni al FAD e il FAD è riossidato dal NAD.

La piruvato deidrogenasi funziona da “gate keaper” per l’acetil-CoA, cioè è un regolatore del flusso di acetil-CoA.

Processo di decarbossilazione e riduzione à deidrogenazione (trasferimento di elettroni sul lipoato a cui vengono ridotti i loro gruppi SH à residuo acilico si lega all’atomo di zolfo. Il lipoato è attaccato ad una lisina e si ritiene funzioni da braccio mobile perché raccoglie il residuo del piruvato e porta la coppia di elettroni a ridurre il FAD, il quale a sua volta viene riossidato dal NAD. Quindi il prodotto è il NAD ridotto, il residuo di piruvato, cioè un residuo acetilico, viene invece legato con un legame solfo-estereo, si forma così l’acetil-CoA.

La piruvato deidrogenasi è un complesso enzimatico in grado di ottenere acetilCoA dal piruvato. Questo avviene tramite vari procedimenti:

  • Decarbossilazione del piruvato
  • Formazione di idrossietiltiaminapirofosfato
  • L’acetile viene trasferito al lipoato (coenzima), il quale viene ridotto, si ha quindi ossidazione del residuo -idrossietil- che diventa –acetil-. Un gruppo SH ridotto attacca l’acetile per opera dell’enzima DIIDROLIPOIL TRANSACETILASI
  • La diidrolipoildeidrogenasi riossida il lipoato, trasferendo i 2 idrogeni sul FAD (che diventa FADH2) che è il coenzima di questo enzima
  • Il FADH2 trasferisce poi tramite una deidrogenasi (che ossida il FAD) la coppia di idrogeni sul NAD che diventa NADH + H+

In questa ultima reazione osserviamo che è il NAD che ossida un FAD, e questo fatto, basandosi sulle tabelle dei potenziali redox, sembra un paradosso, in quanto il NAD ha un E0’ (-0,32) minore rispetto al FAD (-0,219). In condizioni standard il potenziale delle coppie redox ci indica la direzione di trasferimento degli elettroni. Basandosi su queste tabelle dovrebbe essere il NAD a mandare gli elettroni al FAD (quindi il NAD ridurrebbe il FAD), ma ciò non avviene perché i valori della tabella degli E0’ si riferiscono ai coenzimi isolati: il FAD ha, se isolato (FAD libero), un determinato potenziale redox. nella realtà esso è legato covalentemente alla sua deidrogenasi, di conseguenza il potenziale redox cambia a causa dell’enzima. La variazione del potenziale redox fa sì che il FAD della piruvato deidrogenasi mandi i suoi elettroni al NAD e non viceversa.

 

Regolazione della piruvato deidrogenasi

Meccanismo allosterico
I prodotti della reazione inibiscono l’enzima: NADH + H+, acetilCoA, CO2.

Il NADH inibisce la diidrolipoildeidrogenasi che lo forma, mentre l’acetilCoA inibisce la diidrolipoamideacetiltrasferasi che lo produce. I reagenti invece agiscono in modo opposto, in particolare NAD+ attiva il primo la diidrolipoildeidrogenasi, mentre il CoASH attiva il secondo enzima del complesso, mentre anche il piruvato stimola il processo, accelerando una reazione che lo utilizza.

Meccanismo covalente
Avviene tramite la fosforilazione/defosforilazione. La piruvato deidrogenasi o enzima E1 esiste infatti in 2 forme: fosforilata o defosforilata. L’enzima E1 se fosforilato è meno attivo. La regolazione covalente avviene carico della piruvato deidrogenasi cinasi (che utilizza una molecola di ATP), la quale è attivata da alti livelli di NADH, AcetilCoA (prodotti). Quindi la presenza di prodotti attiva la chinasi che fosforila e quindi inibisce la piruvato deidrogenasi. E’ invece inibita dalla presenza di ADP, piruvato e TPP. La defosforilazione è effettuata dalla piruvato deidrogenasi fosfatasi (che utilizza una molecola di H2O per liberare fosfato inorganico) la quale è attivata dal Ca2+ (il quale la maggior parte delle volte interviene come stimolatore dei processi). Il calcio stimola la produzione di piruvato deidrogenasi in forma defosforilata, quindi attiva. ADP e piruvato inibiscono la piruvato-deidrogenasi chinasi, impediscono, cioè la fosforilazione della piruvato deidrogenasi, mantenendola defosforilata e quindi attiva.

 

Ciclo degli acidi tricarbossilici

Sir Krebs fu in grado di completare la sequenza di questo ciclo, di cui si sapeva già quasi tutto, tranne le congiunzioni di una particolare sequenza. Le due molecole di piruvato o di lattato hanno ancora il 95% dell’energia contenuta nella molecola di glucosio, e questo giustifica il processo che porta all’ossidazione completa del piruvato per ricavarne tutta l’energia. Quindi a questo punto l’acetilCoA entra nel ciclo per essere totalmente ossidato a 2 molecole di CO2 e per trasferire elettroni su coenzimi ridotti ad opera di specifiche deidrogenasi. Tutti i carburanti organici portano alla formazione di acetil-CoA che dentro al mitocondrio si condensa con ossalacetato, dando inizio al processo. L’acetil-CoA viene totalmente ossidato nel ciclo di Krebs, infatti i suoi due atomi di carbonio sono ossidati a CO2 e liberati. Nella matrice mitocondriale tutti gli enzimi sono liberi, tranne la succinato deidrogenasi, che si ritrova nella membrana interna delle creste mitocondriali.

L’intero processo si svolge quindi nella matrice mitocondriale, esso è suddivisibile in 8 tappe:

 

Tappa 1
E’ una reazione di condensazione tra l’acetilCoA e l’ossalacetato (formato da acido acetico ed acido ossalico), che troviamo alla fine del ciclo, cioè con una molecola di H2O (reazione di condensazione) queste danno luogo al citrato che è il primo degli acidi tricarbossilici. Quindi durante questa reazione, che è catalizzata dall’enzima citrato sintasi (non viene consumato ATP), si libera il coenzima A, mentre l’acetile viene incorporato nel citrato. Il carbonio carbonilico dell’ossalacetato (α-chetoacido, molecola derivabile o progenitore degli aminoacidi) si lega al metile dell’acetilCoA. L’enzima citrato sintasi necessita di H2O e libera il CoA-SH. L’ H2O provvede al rilascio del CoA (per idrolisi) e permette la produzione del citrato.
Abbiamo infatti la seguente reazione: ossalacetato + acetilCoA + H2O à liberazione di coenzima A dal citril-CoA e formazione del citrato (un acido tricarbossilico dissociato a pH cellulare). Inoltre tale reazione è molto favorita dal punto di vista termodinamico, infatti ha un DG°’= -32.2 kJ/mole (vicino a quello dell’ idrolisi dell’ATP), ed è una tappa irreversibile nelle condizioni cellulari. Poi il citrato a seconda delle condizioni cellulari può proseguire lungo questo sentiero oppure può andare incontro ad altre vie metaboliche.
E questo accade per quasi tutti gli intermedi di Krebs perché questo ciclo è utilizzato anche per produrre intermedi per altri processi metabolici, difatti è un ciclo per definizione aperto. Allo stesso tempo però ci sono reazioni dette anaplerotiche o di riempimento in cui si vedono dei composti che si trasformano in intermedi del ciclo di Krebs e continuano nel ciclo stesso.

Gli α-chetoacidi possono derivare o essere i precursori degli aminoacidi. L’ossalacetato (che è un α-chetoacido a 4 atomi di carbonio) deriva o può essere il precursore dell’aminoacido aspartato (in cui il gruppo α-aminico prende il posto del gruppo chetonico, dell’ossigeno). Esso è in equilibrio con tale α-aminoacido e si interconvertono tramite la catalisi degli enzimi aminotranferasi (o transaminasi). (La differenza tra le sintasi e le sintetasi è che nelle sintetasi interviene l’ATP, nelle sintasi no).

 

Tappa 2
Formazione dell’isocitrato da citrato, con un intermezzo di cis-aconitato grazie all’ enzima aconitasi che toglie una molecola d’H2O dal citrato e forma il cis-aconitato. Il cis-aconitato così ottenuto non è in forma libera ma rimane attaccato all’enzima, fino a quando non viene riaggiunta una molecola di H2O, rimessa in posizione diversa (con opposito orientamento) e si forma l’isocitrato, isomero del citrato (che presenta il gruppo –OH in posizione diversa rispetto alla molecola iniziale). La reazione è all’equilibrio ma non è favorita, infatti abbiamo DG°’= +13.3 kJ/mole, ma questo non è un vero ostacolo se abbiamo disponibilità di reagenti e se il prodotto viene rimosso attivamente come in questo caso. Bisogna inoltre sottolineare che questo non è l’unico destino del citrato, infatti il citrato non può uscire facilmente dalla matrice mitocondriale perché ha 3 cariche negative, e quindi non riesce ad attraversare il doppio strato lipidico. Esiste però un trasportatore che gli consente di uscire nel citoplasma seguendo il gradiente di concentrazione in caso di accumulo. Nel citoplasma inibisce allostericamente la PFK1 e quindi la glicolisi. Inoltre è il citrato che porta fuori dalla matrice mitocondriale l’acetilCoA che si è formato nella matrice stessa ad opera della piruvato deidrogenasi, che deriva cioè dal catabolismo glucidico. Poi nel citosol l’acetilCoA viene utilizzato per produrre acili. Quindi la macchina per fabbricare gli acidi grassi, componente più importante dei triacilgliceroli, parte dal precursore acetilCoA, infatti se si mangiano troppi glucidi, il citrato non prosegue nel ciclo di Krebs, il cui scopo è produrre ATP infatti quando siamo in iperglicemia, l’ATP è già presente sufficientemente, ma abbandona il mitocondrio con un trasportatore associato alla membrana interna del mitocondrio. Poi fuori dal mitocondrio il citrato viene scisso da un enzima in ossalacetato e in acetilCoA che entra nella macchina per fare gli acidi grassi (acili).

 

Tappa 3
A questo punto l’enzima isocitrato deidrogenasi NAD e Mg2+ dipendente causa la deidrogenazione dell’ isocitrato e la decarbossilazione ossidativa dell’isocitrato. L’enzima può avere come coenzima il NAD ma anche il NADP (coenzima delle deidrogenasi che catalizza processi di idrogenazione biosintetici, per esempio nella formazione del colesterolo e nella riduzione degli acidi grassi si usa il NADPH). Il NADPH non partecipa poi al metabolismo energetico, non viene cioè riossidato nella fosforilazione ossidativa ( al contrario del NADH).

Questo enzima è inibito allostericamente da NADH e ATP, mentre risulta essere disinibito da NAD+ e ADP. Esso si trova, in base allo stato di associazione delle sue subunità, in due forme: una forma associata attiva ed una dissociata inattiva. La regolazione di questo cambio di struttura è quindi regolata dalle molecole sopra citate (NADH/ATP e NAD+/ADP). Le deidrogenasi che usano il NAD non usano normalmente il NADP e viceversa, ma ci sono alcune eccezioni. In particolare si osserva che la forma NADP dipendente si trova sia nei mitocondri che nel citoplasma. Questo enzima catalizza una deidrogenazione accompagnata da una decarbossilazione, la prima ha infatti per conseguenza la seconda. Quindi uno dei gruppi COO- dell’isocitrato esce sottoforma di CO2, si forma NADH + H+ e si produce l’a-chetoglutarato, che è l’ a-chetoacido dell’ aminoacido glutammato (di 4 atomi di carbonio, è un neurotrasmettitore, che presenta al posto del gruppo carbossile dell’a-chetoacido il gruppo aminico), infatti in presenza delle aminotrasferasi si passa dall’uno all’altro. Bisogna inoltre sottolineare che la reazione di transaminazione del glutammato in a-chetoglutarato è un esempio di reazione anaplerotica, lo stesso vale per la transaminazione dell’ aspartato in ossalacetato o dell’alanina in piruvato. Bisogna infine osservare che anche la reazione che avviene in questa tappa è irreversibile e quindi favorita come la reazione della 1° tappa, infatti ha un DG°’ = – 20,9 kj/mole, negativo ed elevato in valore assoluto.

 

Tappa 4: decarbossilazione ossidativa dell’ α-chetoglutarato
Successivamente l’a-chetoglutarato è soggetto ad un trasformazione complessa, infatti fa da substrato in un complesso enzimatico del tutto simile alla piruvato deidrogenasi, che aveva il piruvato come a-chetoacido che faceva da substrato. Qui invece il complesso dell’a-chetoglutarato deidrogenasi ha l’a-chetoglutarato come substrato, quindi questi due complessi sono simili in quanto agiscono entrambi su un a-chetoacido, anche se appartengono a due sequenze metaboliche diverse. In particolare questo complesso enzimatico è formato degli stessi 5 coenzimi (TPP, acido lipoico, FAD, NAD e CoA) e da 3 enzimi: glutammatodeidrogenasi, diidrolipoamidetransacilasi e diidrolipoamidedeidrogenasi. Questo enzima presenta inoltre le stesse tappe della piruvato deidrogenasi. Nello specifico l’a-chetoglutarato deidrogenasi che è una deidrogenasi NAD dipendente, produce NADH + H+, CO2 e succinilCoA (succinato montato sul coenzima A, aggiunto alla reazione), che è una molecola ad alta energia. Si tratta di un acile a 4 atomi di carbonio legato tramite un legame tioestereo altamente energetico al CoA. Il ΔG°’ di reazione è -33,5 kj/mole, è molto alto e il processo è irreversibile.

 

Tappa 5: conversione del succinil-coa a succinato
In questa tappa il legame tioestereo della molecola di succinilCoA, viene scisso, con formazione di succinato e liberazione di molta energia, (DG°’ di idrolisi = -36.6kJ/moli) che viene utilizzata per produrre GTP (da GDP + Pi) che poi verrà trasformato in ATP. I ricercatori all’inizio nello studio di questo enzima studiarono la reazione inversa, cioè quella che a partire da succinato e GTP produce succinilCoA, per mezzo dell’enzima SUCCINIL-COA SINTETASI (che catalizza questa reazione che è reversibile), può avvenire quindi anche la reazione inversa che a partire da succinilCoA e GDP produce GTP e succinato, liberando CoA-SH). Quindi entrando nello specifico abbiamo l’idrolisi del legame tioestere, la liberazione del CoA-SH e la trasformazione del succinil-CoA in succinato. Per quanto riguarda il GDP abbiamo che tale molecola consente di raccogliere parte dell’energia rilasciata, infatti c’è un meccanismo che consente di fare dal GDP una molecola di GTP ( che viene utilizzato, per esempio, dalla proteina G e nella sintesi degli acidi nucleici) che poi esce. Il GTP corrisponde quindi dal punto di vista energetico all’ ATP, difatti esiste un enzima, il nucleotide difosfato chinasi (consente la fosforilazione reversibile dei nucleotidi), che se ha GTP a disposizione e gli manca ATP, forma GDP e ATP e viceversa. Se infatti necessita di GTP può catalizzare il trasferimento del fosfato sul GDP dall’ATP e formare GTP e ADP.

GTP + ADP↔GDP + ATP

Questa dopo le 2 viste durante la glicolisi è la terza e ultima fosforilazione a livello del substrato, che avviene non attraverso la respirazione cellulare.

La miochinasi è una adenilato chinasi a livello muscolare permette anche l’uso di ADP in caso di necessità cellulare nel muscolo scheletrico. Avviene quindi la liberazione del fosfato β. Si forma AMP, che deve essere riconvertito ad ATP: la riconversione avviene ad opera di questo enzima miochinasi.

 

Tappa 6: ossidazione del succinato
Il succinato è il substrato dell’unico enzima, succinato deidrogenasi FAD dipendente (è una flavoproteina che lega il coenzima FAD, forma coenzimatica della B2 o riboflavina), che è presente nella membrana interna delle creste mitocondriali, al contrario degli altri enzimi del ciclo di Krebs, che sono liberi nella matrice. L’enzima strappa 2 idrogeni al succinato, trasferendoli sul FAD che diventa FADH2, viene così formato fumarato trans, che è riconosciuto dall’enzima successivo.

Gli elettroni dal FADH2 si muoveranno poi verso l’ubichinone o coenzima Q, il quale è uno dei trasportatori di elettroni della catena respiratoria, esso è “in soluzione” nello spazio delle catene degli acidi grassi dei fosfolipidi della membrana delle creste mitocondriali (usato dagli atleti per aumentare le prestazioni). Esiste un meccanismo di inibizione competitiva, infatti il sito attivo della succinato deidrogenasi (che riconosce il succinato per trasformarlo in fumarato) è inibito dal competitivamente dal malonato e dall’ossalacetato. La inibizione può essere rimossa aumentando la concentrazione del substrato (succinato). Il ΔG°’ è 0 kj/mole, il processo è quindi reversibile.

 

Tappa 7: Idratatazione del fumarato per produrre L-malato, a questo punto l’enzima fumarasi agisce sul fumarato introducendo in modo stereospecifico gli elementi dell’H2O , si forma così il Levo-malato (L-malato). Il D-malato non sarebbe riconosciuto dall’enzima successivo. Il ΔG°’ -3,8 kj/mole, la reazione è in equilibrio.

 

Tappa 8: Ossidazione del malato ossalacetato, si ha ancora una deidrogenasi NAD dipendente (la malato deidrogenasi) che porta via 2 idrogeni e si forma l’ossalacetato insieme al NADH + H+. Questa reazione, che è reversibile, è molto sfavorita dal punto di vista termodinamico, infatti ha un DG°’= +29.7kJ/mole, ma avviene comunque perché la reazione successiva, che porta via ossalacetato (per azione della citrato sintasi), è molto favorita, (DG°’= -32.2kJ/mole). Infine oltre al fatto che l’ossalacetato è mantenuto a concentrazioni basse, anche il NADH viene riossidato attivamente nella fosforilazione ossidativa, quindi è anch’esso tenuto a basse concentrazioni.

La reazione complessiva è quindi:

3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + AcetilCoA è 3NADH (+ 3H+) + FADH2 + GTP + CoA + 2 CO2

Si verifica quindi la completa ossidazione dei carburanti introdotti nell’organismo. L’energia che si libera dal processo è conservata dalle coppie di elettroni ad alta energia dei 3 NADH e del FADH2, si tratta quindi di molecole molto energetiche. Le deidrogenasi NAD dipendenti producono 3 molecole di NADH, mentre la succinato deidrogenasi produce una molecola di FADH2.

Il carburante lipidico è più energetico di quello glucidico perchè ha più idrogeni da donare, di conseguenza si formano più coenzimi che entrano nella catena respiratoria.