Regolazione Ormonale

Amplificazione

Fenomeno caratteristico delle vie di trasduzione: consiste in una serie di step enzimatici che amplificano il messaggio portato dall’ormone 

Da una molecola ormonale che si lega al recettore, viene attivata una proteina G, la quale a sua volta attiva l’enzima effettore (adenilato ciclasi). Una proteina “adenilato ciclasi” produce circa un centinaio di molecole cAMP ( 1 ormone fa partire 100 cAMP). Sono necessarie 4 molecole cAMP per attivare una PKA (2 per ogni subunità regolatoria) quindi secondo questo conteggio se ne attivano circa 25.


La PKA attivata si occupa di fosforilare le varie proteine: nella glicogenolisi la PKA va ad attivare la fosforilasi chinasi. Si attivano quindi una serie di chinasi, in grado di produrre grandi quantità di glucosio. Facendo una stima finale delle molecole di glucosio ottenute con una singola molecola di ormone: 1 ormone porta a 10.000 molecole di glucosio. Gli ormoni sono poco concentrati, ma sono in grado di evocare una grande risposta enzimatica, questo grazie agli step enzimatici che amplificano il messaggio.

Il processo arrivati ad una certa fase deve essere inibito, la cellula non può rimanere in un perenne stato attivato.

La via del cAMP porta a modificazioni covalenti degli enzimi, che sono transitorie (da pochi minuti a qualche ora) e covalenti degli enzimi. Altre modificazione invece sono definite a lungo termine, in quanto coinvolgono la sintesi proteica. Anche la via del cAMP è in grado di attivare o inibire la trascrizione di certe proteine.

 

Regolazione genica a controllo ormonale

Ricordiamo che la molecola PKA è composta da 2 subunità regolatorie e 2 catalitiche. L’enzima si attiva dopo il legame con 4 cAMP, che causa il distacco delle subunità catalitiche (nel citoplasma).

La subunità catalitica della PKA può entrare nel nucleo, fosforila varie proteine, tra cui i fattori di trascrizione. Una fattore di trascrizione comunemente presente all’interno dei nuclei è il fattore CREB (proteina che lega la sequenza CRE: quando viene fosforilata dalla PKA, CREB-P si lega alla sequenza CRE presente sul DNA).

La sequenza CRE (TGACGTCA) consiste negli elementi responsivi al cAMP (sequenza di DNA presente sul promotore del gene che verrà trascritto). E quindi la proteina CREB presente nei promotori dei geni che devono essere regolati da questa via, è sostanzialmente, in ultima analisi, una binding protein.

Il fattore di trascrizione si trova nel nucelo e viene fosforilato dalla PKA che entra nel nucleo.

Una volta fosforilato si lega come dimero alla sequenza CRE (presente nei promotore dei geni che saranno attivati), di cui riconosce la sequenza di basi TGACGTCA.

La proteina è attiva se fosforilata dalla PKA che è entrata nel nucleo. Al segnale partecipa un cofattore positivo chiamato CBP (creb binding protein), il quale si lega a CREB solo quando questo è fosforilato. Si forma così un complesso sul promotore costituito da CREB-CBP che permette l’inizio della trascrizione dei geni.

Il risultato è la produzione di proteine sotto il controllo di questa via e la variazione di concentrazione di queste proteine enzimatiche.

Si tratta di una regolazione a lungo termine, si instaura in un tempo relativamente lungo (ore/giorni) e richiede altrettanto tempo affinchè termini il processo.

Esempio: Quando il glucagone si lega agli epatociti viene attivata la regolazione genica dei seguenti enzimi:

  • inibizione della glucochinasi (glicolisi)
  • attivazione enzimi della gluconeogenesi (che aumentano di concentrazione)

Infatti sappiamo che nel fegato il glucagone attiva la gluconeogenesi ed inibisce la glicolisi.

 

Down regulation e desensibilizzazione

Abbiamo detto che il processo ad un certo punto deve essere disattivato: deve esere spento il segnale portato dall’ormone.

Rivediamo l’intera sequenza:

  1. Legame ormone-recettore
  2. Attivazione proteina G (con la sub unità α legante un GDP)
  3. Distacco delle sub unità α(che ha scambiato GDP con GTP)
  4. Attivazione adenilato chinasi
  • La sub unità α presenta, essa stessa, una attività GTPasica intrinseca (può idrolizzare il GTP ad essa legato). In seguito alla idrolisi della molecola di GTP, essa perde affinità per l’enzima adenilico ciclasi, dal quale si stacca per ricombinarsi alle sub unità β e γ per riformare la proteina G. Si verifica quindi la interruzione della attivazione della adenilato ciclasi.
  • Il cAMP che si è formato viene degradato ad opera della fosfodiesterasi, il quale trasforma il cAMP ad AMP (che non ha potere di secondo messaggero, nonostante vada a riflettere la propria azione su altre vie, infatti ci sono anche chinasi AMP dipendenti, poi l’AMP attiva al glicolisi e il ciclo di Krebs). La diminuita concentrazione citoplasmatica di cAMP fa si questo si stacchi dalle subunità regolatrici della PKA, le quali si riassociano alle sub unità catalitiche, inattivandole.

Sostanze come la caffeina, teina e la teobromina sono in grado di inibire la fosfodiesterasi, inibendo così la desensibilazione del recettore, e mantenendo il soggetto in stato di attività, poiché mantengono il segnale eccitatorio dell’ormone (infatti la via dell’ cAMP viene seguita anche dall’ormone adrenalina)

  • Rimane il problema degli enzimi che erano stati fosforilati.

Il glucagone è l’omone del digiuno, quando si instaura una situazione di buona alimentazione si inverte il rapporto glucagone/insulina (il glucagone diminuisce e l’insulina aumenta).
L’insulina attiva sia le fosfodiesterasi che le fosfatasi, le quali rimuovono i gruppi fosforici introdotti dall’azione del glucagone. Così si ha uno spegnimento della via.
Il glucagone rimasto in circolo ha però ancora il potere di legarsi ai recettori e riattivare la via.

Anche i recettori hanno un processo di disattivazione, in particolare si ha una desensibilizzazione omologa ed una eterologa:

omologa = se l’ormone è legato al recettore (l’esempio riportato è quello della adrenalina), si avvicina al complesso una β adrenegic receptor chinasi, cioè una chinasi che fosforila in modo specifico il β recettore. Esso fosforila i residui di serina e treonina presenti nel dominio C terminale del recettore e così viene inibita la affinità per le proteine G. Il recettore, pur legando l’ormone, diminuisce la propria attività per le proteine G e quindi non le lega più. Al complesso ormone-recettore fosforilato si lega un’altra proteina, la β arrestina. Essa facilita la invaginazione del complesso ligando-recettore, i quali vengono inglobati in vescicole citoplasmatiche, con il risultato di una DOWN REGULATION dei recettori (ovvero una diminuzione del numero di recettori sulla membrana plasmatica). La desensibilizzazione è detta omologa perché la chinasi agisce su un recettore specifico, e solo quello viene inattivato.

Le vescicole così ottenute avranno diverso destino, in quanto possono essere depositate all’interno della cellule e richiamate sul plasmalemma in caso di necessità, oppure fondersi con i lisosomi ed essere degradate totalmente. Quindi appena parte il processo di trasduzione del segnale, parte contemporaneamente anche il fenomeno di desensibilizzazione. La caffeina e la teofillina inibiscono la fosfodiesterasi, permettendo il mantenimento del segnale eccitatorio, mantenendo per tempi più lunghi le concentrazioni di cAMP.

Eterologa = la attivazione via della può essere dovuta alla azione di diversi ormoni, come catecolamine e il gucagone. Nella via di trasduzione dell’ormone avviene che la stessa PKA fosforila il recettore. Essa non fosforila però solo il recettore β delle catecolamine, ma anche il recettore del glucagone, in quanto entrambi sono in grado di attivare la via del cAMP. In sintesi l’aumento di concentrazione della PKA causa la fosforilazione di recettori diversi, che hanno però lo stesso meccanismo di trasduzione. Si ha quindi il fenomeno di desensibilizzazione eterologa, perché agisce anche su altri recettori non coinvolti nel processo.

Via del fosfatidil inositolo 4-5 bifosfato

Torniamo a completare il discorso sulle vie di trasduzione del segnale: quando si forma un complesso ormone-recettore α1 abbiamo come secondo messaggero non più cAMP ma Ca++ oppure la via del metabolismo del fosfatidilinositolo. Questi fosfatidilinositoli derivano dai fosfolipidi di membrana, infatti il fosfatidilinositolo o PI viene fosforilato da una molecola di ATP grazie all’enzima PI cinasi, si forma così il fosfatidilinositolo-4-fosfato, si chiama PI-4-P, poi un altra cinasi, la PI-4-P cinasi fosforila il carbonio 3, poi sul nuovo PI-3,4-P2 agisce una fosfolipasi specifica che idrolizza il fosfatidilinositolo liberando i due acidi grassi o diacilgliceroli, formanti ora il DAG, e l’inositolo trifosfato o IP3: questi sono due secondi messaggeri. Se la fosfolipasi agisce sulla PI, sul PI-4-P o sul PI-3,4-P2 produce rispettivamente I-1-P, I-1,4-P2, I-1,3,4-P3, oltre al DAG che è sempre prodotto.
Questa via può essere attivata da un ormone polipeptidico, che va ad interagire con un recettore legato alla proteina G, la cui subunità α rilascia GDP ed acquista GTP, va poi ad attivare la fosfolipasi C-β, un enzima presente a livello della membrana plasmatica, che a sua volta libera l’I-1,4,5-P3 o IP3, che permette il rilascio dello ione calcio, derivante dal reticolo sarcoplasmatico o dall’esterno e molto importante nei processi di contrazione o nell’attività della glicogeno fosforilasi cinasi quando è legato alla calmodulina, ma anche di altre proteine calcio/calmodulina dipendente.
Il DAG è un secondo messaggero che rimane a livello della membrana plasmatica, attivando una proteina cinasi che è la proteina cinasi C, la cui massima attività è prerogativa della presenza di fosfatidilserina, e questa cinasi attiva la fosforilazione di altre proteine bersaglio, portando a diverse risposte cellulari. L’IP3 torna poi come IP all’interno della membrana plasmatica dopo alcune reazioni attraverso particolari fosfatasi che eliminano due gruppi fosfato dall’IP3 quando il segnale è già stato inviato. (preso dall’ultima parte della respirazione cellulare).

Anche in questo caso la formazione del complesso ligando-recettore determina la trasduzione del segnale. Il trasduttore rimane la proteina, inoltre in questo caso la proteina stimolatoria prende il nome di proteina Q. Essa ha sempre il compito di trasdurre il segnale dal recettore all’enzima effettore, che è la fosfolipasi C (PLC). Si formano quindi secondi messaggeri, i quali vanno ad attivare delle chinasi, che a loro volta indurranno la risposta della cellula a quell’ormone.

Anche i questo caso avviene il fenomeno di amplificazione del segnale.

Il recettore di questi ormoni presenta un dominio trans membrana composto da 7 α eliche, cioè la catena polipeptidica attraversa 7 volte il plasmalemma.

 

ATTIVAZIONE DELLA FOSFOLIPASI C:

L’ormone polipetidico (per esempio l’adrenalina) si lega ai recettori α1. Le proteine G (GQ) sono legate al recettore. La proteina G nello stato di riposo presenta legato un GDP, dopo la formazione del complesso ligando recettore avviene un cambiamento di conformazione (il GDP è scambiato con il GTP) e ciò fa sì che la subunità α migri lateralmente e raggiunga l’effettore (PLC-β).

Il substrato dell’enzima fosfolipasiC è il fosfatidil inositolo 4,5-bifosfato, il quale viene scisso in IP3 e DAG (diaciglicerolo).

Il fosfolipide in questione è caratterizzato dalla presenza del glicerolo eseterificato con 2 catene di acidi grassi, un gruppo fosforico con legato un alcol (a seconda del fosfolipide può essere colina, etanolamina ed inositolo).

Si distinguono diverse fosfolipasi, a seconda della posizione in cui il fosfolipide viene attaccato:

  • A1 = scinde l’acido grasso in posizione 1 sul glicerolo
  • A2 = scinde l’acido grasso in posizione 2 sul glicerolo
  • C = idrolizza il legame tra glicerolo e gruppo fosforico, causando il distacco del gruppo Pi-alcol
  • D = scinde l’alcol lasciando l’acido fosforico

Il substrato della fosfolipasi C è il fosfatidil inositolo 4-5 bifosfato, dovranno perciò intervenire chinasi che introdurranno sul fosfatidil inositolo, che è presente sulla membrana plasmatica, progressivamente gruppi fosfati in posizione 4 e 5. Rispettivamente:

  • fosfatidil inositolo 4 chinasi è fosfatidil inositolo 4 fosfato
  • fosfatidil inositolo 5 chinasi è fosfatidil inositolo 4-5 bifosfato

La fosfolipasi C (enzima di membrana rivolto verso il citoplasma), riconosce la molecola e la scinde a livello del legame tra glicerolo e gruppo fosforico, causando la formazione di diacil glicerolo (DAG) e inositolo 1,4,5 trifosfato (IP3), queste sono le due molecole utilizzate come secondi messaggeri:

  • Il DAG è una molecola liposolubile in grado di restare ancorata alla membrana plasmatica.
  • L’IP3 per la presenza dei 3 gruppi fosforici è una molecola molto solubile, che rimane quindi libera nel citoplasma.

Complesso ligando-recettore è attivazione della proteina G è migrazione della sub unità α verso l’effettore fosfolipasi C è formazione DAG (che rimane nella membrana) e IP3 (che migra nel citoplasma)

  • L’IP3 migra verso il reticolo endoplasmatico, all’interno del quale si trova un’alta concentrazione di ioni Ca2+ .

A livello citoplasmatico la concentrazione del Ca2+ è mantenuta molto bassa, in quanto esso può essere considerato come un secondo messaggero in grado di avocare diversi fenomeni come la contrazione muscolare o la attivazione di Chinasi Ca2+ dipendenti. Il calcio si può legare alla calmodulina (proteina citoplasmatica) in grado di attivare altre chinasi. Per evitare la attivazione continua di questi fenomeni la concentrazione citoplasmatica del calcio è mantenuta a livelli molto bassi, almeno rispetto alla concentrazione extracellulare ed intrareticolare.

L’IP3 raggiunge le membrane del RE, sulle quali sono presenti dei canali con recettori in grado di legarlo. Dopo che l’IP3 si lega al recettore avviene la apertura dei canali del Ca2+ , il quale seguendo il suo gradiente di concentrazione esce dal RE facendo aumentare la concentrazione di Ca2+ citoplasmatica.

  • Il DAG, rimasto a livello della membrana, richiama la proteina chinasi PKC (proteina chinasi C, Ca2+ dipendente). Avviene la formazione del complesso DAG-PKC. La PKC per essere attiva necessita, oltre che del DAG, di alte concentrazioni di Ca2+ , il quale è stato liberato dall’intervento dell’ IP3.

La PKC, essendo una chinasi, si occupa di fosforilare una serie di proteine enzimatiche, le quali risulteranno modificate in modo covalente.

Il Ca2+ è un secondo messaggero, in grado di attivare una serie di reazioni a livello citoplasmatico. In particolare la calmodulina è una proteina citoplasmatica che presenta 4 siti di legame per gli ioni Ca2+ . L’aumento della concentrazione citoplasmatica dello ione fa sì che questo si leghi alla calmodulina. La calmodulina dopo il legame cambia la propria conformazione, acquisendo la affinità per poter legare particolari proteine chinasi calmodulina dipendenti.

Per esempio, la fosforilasi chinasi è l’enzima che fosforila la glicogeno fosforilasi, attivando la glicogenolisi. Si tratta di un enzima formato da più subunità, di cui una è la calmodulina, che fa parte del complesso enzimatico. La fosforilasi chinasi è un enzima regolato in modo covalente dalla PKA (fosforilazione/defosforilazione), ma può essere attivato anche dall’aumento di concentrazione del Ca2+ , grazie alla calmodulina che fa parte del complesso enzimatico. Ciò è importante per esempio a livello muscolare, infatti in seguito all’arrivo del’impulso nervoso alla placca neuromuscolare avviene la depolarizzazione della membrana e l’aumento dei livelli del Ca2+

 

Placca neuromuscolare,neurone

L’aumento della concentrazione di Ca2+ determina sia l’attivazione della contrazione muscolare che l’inizio della glicogenolisi (grazie alla calmodulina), la quale fornisce energia per il mantenimento della contrazione muscolare.

Alcuni canali ionici sono anche essi stessi dei recettori, in grado di legare neurotrasmettitori come la acetilcolina. Quando avviene il legame si ha l’apertura del canale e il movimento degli ioni secondo gradiente di concentrazione. Ci possono poi essere canali ionici legati alle proteine G. L’ormone si lega al recettore, viene attivata la proteina G, le subunità β e γ migrano verso il canale ionico legandosi ad esso e determinandone la apertura. Si ha così l’ingresso di ioni nella cellula, i quali potranno determinare depolarizzazione di membrana (ioni positivi) o iperpolarizzazione di membrana (ioni negativi).

Inattivazione della via IP3/DAG

Esistono chinasi specifiche per i recettori legati a proteine G, esse fosforilano i recettori a livello del dominio C terminale. Anche la stessa PKC, se attivata, è in grado di fosforilare i recettori, impedendo quindi la trasduzione del segnale. Si hanno quindi 2 gruppi di chinasi in grado di fosforilare il recettore, diminuendone la sensibilità e quindi la traduzione del segnale. La fosforilazione da parte dei 2 gruppi avviene però su siti diversi.

Anche la concentrazione del Ca2+ deve essere abbassata. La PKC si occupa di fosforilare i canali del Ca2+ di membrana, aprendoli e determinando la fuoriuscita del calcio. Anche i canali presenti sul reticolo endoplasmatico sono inattivati tramite 2 vie:

  • IP3 viene idrolizzato a IP2 +Pi, perdendo la propria attività funzionale.
  • Gli alti livelli di calcio chiudono essi stessi i canali: i canali ionici sono sensibili alla concentrazione dello ione.

Non fuoriesce più calcio,ed inoltre questo viene portato fuori dalla cellula

Poiché, però, la cellula ha bisogno di mantenere dentro una determinata quantità di Ca, ci sono pompe in grado di trasportare attivamente il Ca2+ citoplasmatico all’interno del RE

Il DAG viene recuperato. Il secondo messaggero IP3 è substrato di una fosfatasi che rimuove un Pi, con la formazione di IP2, il quale a sua volta è il substrato di un’altra fosfatasi che lo trasforma in IP1. Alla fine si ottiene una molecola di inositolo che torna alla membrana e si lega al DAG, il quale è stato attivato da un CTP (citidin trifosfato).

DAG + CTP è CDP-glicerolo

CDP-glicerolo + inositolo è riformazione del fosfolipide di membrana

 

Le Catecolamine

Le catecolamine, adrenalina e noradrenalina, sono prodotte sia a livello dei neuroni del sistema nervoso, che le rilasciano nelle sinapsi, sia a livello da ghiandole endocrine, più precisamente le ghaindole surrenali.

Osservando in sezione una ghiandola surrenali possiamo notare che essa è costituita da una parte corticale ed una midollare, le quali producono ormoni diversi:

  • midollare è catecolamine (80% adrenalina, 20% noradrenalina)
  • corticale è mineralcorticoidi, glucocorticoidi e ormoni androgeni

Si ha un contatto funzionale tra le due parti grazie alla circolazione, infatti il sistema circolatorio che attraversa tutta la ghiandola surrenale raccoglie il secreto della parte corticale, in seguito passa nella parte midollare per confluire poi nelle vene surrenali.

Gli ormoni ipofisari viaggiano attraverso la circolazione fino alla ghiandola surrenale, in particolare l’ormone ACTH (adenocorticotropo) è in grado di stimolare la corteccia della surrenale nella produzione di ormoni steroidei (corticosteroidi). Tra gli ormoni prodotti dalla corticale troviamo il corticosteroidi, i quali sono in grado di attivare l’enzima responsabile della sintesi delle catecolamine nella midollare surrenale. Si ha quindi un contatto diretto e funzionale tra la corticale e la midollare surrenale.

Sintesi delle catecolamine:

Si parte dalla fenilalanina, la quale per idrossilazione forma la tirosina. Oppure si può partire dalla tirosina, la quale attraverso la azione di una idrossilasi forma diossifenialanina. In seguito una decorbossilasi elimina il gruppo carbossilico della Dopa, con la formazione di Dopamina.

Interviene quindi una dopamina β idrossilasi, la quale introduce un gruppo OH a livello del C2 della dopamina e si forma la noradrenalina. Infine per azione della fenil etano lamina-N-metil trasferasi viene introdotto un gruppo amminico sull’N e si forma adrenalina.

Questa via biosintetica porta quindi prima alla formazione della noradrenalina, poi per la presenza dell’enzima fenil etanolamina-N-metil trasferasi che viene attivato dai glucocorticoidi della corteccia. Questo enzima promuove la trasformazione di noradrenalina in adrenalina, che raggiungono le percentuali rispettivamente di 20% e 80%, grazie alla attivazione di questo enzima.

 

RECETTORI:

I recettori delle catecolamine, come abbiamo accennato, hanno 7 alfa eliche che attraversano la membrana e sono accoppiati alle proteine G.

  • Quando adrenalina e noradrenalina si legano ai recettori β si attiva la via adenilico ciclasi stimolatoria. L’effettore è stimolato dalle proteine αs appartenenti alla proteina G, si forma cAMP che a sua volta attiva la PKA. Ricordiamo che la β arrestina promuove la down regulation di questi recettori.
  • Se le catecolamine si legano ai recettori α1 la via di trasduzione del segnale è quella del fosfatidil inositolo. In questo caso si attiva la proteina GQ, la quale attiva la fosfolipasi C, che a sua volta determina la formazione di IP3 e DAG, segue la liberazione di ioni Ca2+ che vanno ad attivare la PKC.
  • Se infine si legano ai recettori α2 si attiva la via cAMP inibitoria. Queste proteine G possiedono infatti una sub unità αi di tipo inibitorio, essa migra verso l’effettore adenilato ciclasi inattivandolo, causando quindi la diminuzione di produzione di cAMP e di attività della PKA. Ha quindi un effetto antagonista rispetto a quello dei recettori β.
  • Se andiamo a vedere ciò che succede per le catecolamine (in particolare consideriamo gli ormoni agonisti epinefrina, norepinefrina, fenilefrina e isoproterenolo), vediamo che i loro recettori possono suddividersi in α-recettori, in cui il secondo messaggero dell’α1 è rappresentato dal calcio e dal fosfatidilinositolo, mentre per l’α2 il secondo messaggero è il cAMP. Per le due forme dei recettori β invece il secondo messaggero è sempre rappresentato dal cAMP (i recettori β1 adrenergici sono quelli che più si risentono a livello del nostro corpo, come la contrazione del cuore). Abbiamo dunque visto che non esiste una corrispondenza univoca tra recettori, agonisti e secondi messaggeri.

 

Metabolismo

La liberazione in circolo delle catecolamine promuova la attivazione della adenilato ciclasi, attivazione della PKA che fosforila la fosforilasi chinasi, la quale a sua volta attiva la fosforilasi A e avviene la demolizione del glicogeno (glicogenolisi). La fosforilasi chinasi è una complesso enzimatico formato da 4 subunità:

  • γ = subunità catalitica
  • α e β = sono le subunità regolatrici, fosforilate dalla PKA
  • δ o calmodulina = si tratta di una molecola normalmente libera nel citoplasma, che in questo caso fa parte del complesso enzimatico.

L’enzima può essere attivato tramite 2 modalità:

  • fosforilazione delle subunità α e β
  • grazie alla’aumento di Ca2+ citoplasmatico che si lega alla calmodulina

Il massimo della attività enzimatica si ha quando sono presenti entrambe le modalità.

Lo stesso meccanismo fosforila la glicogeno sintasi A la quale una volta fosforilata risulta inattiva, con inibizione del glicogeno sintesi.

Se le catecolamine si lega al recettore α1 avviene la attivazione della proteina GQ, che attiva la fosfolipasi C, con la liberazione di ioni calcio e l’attivazione della PKC.

I recettori α2 attivano la via del cAMP inibitoria. Quindi si ha una subunità α inibitoria, che si stacca e inattiva la adenilato ciclasi, diminuenda la attivazione della PKA.

A livello del tessuto adiposo la adrenalina si lega al suo recettore β attivando la via del cAMP, ciò porta alla fosforilazione da parte delle PKA della trigliceride lipasi che scinde i trigliceridi in glicerolo ed acidi grassi. Il glicerolo sarà riversato in circolo assieme agli acidi grassi, i quali andranno a fornire energia al fegato e agli altri tessuti.