Metabolismo delle Basi Azotate

Basi azotate = basi che vengono trasformate nei vari nucleotidi purinici e pirimidinici che hanno un ruolo molto importante nei vari tessuti

Funzioni delle basi azotate

  • Base di partenza per sintesi di DNA e RNA sottoforma di nucleotidi e deossiribonucleotidi
  • ATP = principale forma di riserva energetica per l’organismo (utilizzato ogni volta che abbiamo necessità di attivare delle molecole tramite fosforilazione)
  • CTP = utilizzato per l’attivazione di determinate molecole (come il glicerolo) nella sintesi dei fosfolipidi
  • GTP = interviene nella reazione di sintesi delle proteine
  • UTP = nella sintesi del glicogeno
  • Entrano nella costituzione del NAD e del FAD
  • Entrano nella costituzione del CoA
  • Ruolo fondamentale nella trasmissione del segnale ormonale (es. cAMP)
  • Agiscono come regolatori metabolici (es. ATP e AMP come modulatori della glicolisi)

Basi puriniche:

  • Adenina
  • Guanina
  • Ipoxantina
  • Xantina

Basi pirimidiniche:

  • citosina
  • uracile
  • timina

A queste basi azotate si lega il ribosio all’N-9 delle purine a all’N-1 delle pirimidine formando i nucleosidi corrispondenti. Ai nucleosidi si aggiunge un gruppo fosforico in posizione 5’ formando il nucleotide corrispondente

I deossiribonucleotidi differiscono perché nella posizione 2’ del ribosio non è presente l’OH

Nucleoproteine per le basi azotate possono essere introdotte anche con la dieta. Una prima digestione avviene a livello intestinale ad opera di enzimi prodotti dal succo pancreatico: le nucleasi. Le nucleasi scindono lunga catena dell’acido nucleico in spezzoni più corti rappresentati da oligonucleotidi. Poi intervengono delle fosfodiesterasi che scindono gli oligonucleotidi nei vari nucleotidi, questi nucleotidi sono scissi ad opera di nucleotidasi, sempre a livello intestinale, e si formano i nucleosidi corrispondenti (senza il gruppo fosforico), poi intervengono le nucleosidasi che staccano lo zucchero formando le basi azotate semplici. Le basi azotate semplici sono assorbite a livello intestinale, ma non utilizzate completamente da nostro organismo, la maggior parte infatti è distrutta a livello intestinale, solo una parte è recuperata dagli enterociti ad opera di un enzima di recupero, una fosforibosil trasferasi che riattacca lo zucchero ribosio fosforilato permettendo la riformazione dei nucleotidi all’interno dell’intestino.

Abbiamo detto che la stragrande maggioranza della basi azotate non è introdotta con la dieta, ma sintetizzata a livello di vari tessuti, specie in quelli in attiva proliferazione dove si ha un continuo ricambio di cellule (epiteli di rivestimento, midollo osseo)

Sintesi delle purine

ALL’ESAME : non bisogna sapere tutte le tappe intermedie di questa via biosintetica, ma solo i composti da cui sono prelevati i vari componenti dell’anello e le tappe di regolazione

Scheletro delle purine: la numerazione parte dall’N in alto a sinistra, poi continua in senso antiorario e si passa sull’altro anello in alto

Le molecole che vengono utilizzate per costruire passo a passo l’anello purinico sono:

  • N-3 e N-9 = da glutammina
  • C-8 e C-2 = da N10-formil tetraidrofolico (tutti e due! La diapo è sbagliata)
  • C-6 = da CO2
  • N-1 = da aspartato
  • C-4, C-5, N-7 = da glicina

Sono tutte molecole molto semplici di cui le cellule sono provviste in abbondanza (se la dieta è corretta, perché gli aminoacidi di cui c’è bisogno non sono aminoacidi essenziali ma sono introdotti con la dieta).

La prima reazione che avviene non fa propriamente parte del processo di sintesi delle purine, o meglio, non è una reazione esclusiva di questo procedimento perché il fosforibosil pirofosfato viene utilizzato anche nella sintesi dei nucleotidi pirimidinici oppure per recuperare le basi che derivano dal catabolismo di DNA e RNA. Si tratta per altro di una reazione che non avviene sempre benché sia molto importante perché altamente regolata.

Si parte dal ribosio-5-fosfato che si forma nella via dei pentosi e che deve essere ulteriormente energizzata, attivata tramite fosforilazione, viene allora introdotto un PPi donato da un ATP che diventa ADP e prelevato dall’enzima 5-fosforibosil pirofosfato sintetasi. Il pirofosfato serve ad attivare il C-1 sul quale andremo a sintetizzare progressivamente l’anello purinico.

Ribosio-5-fosfato + ATP à 5-fosforibosil pirofosfato sintetasi à 5-fosforibosil pirofosfato + ADP

Iniziamo ora il vero e proprio processo di sintesi.

Sui substrati di 5-fosforibosil pirofosfato (= PRPP) + glutammina (cede il suo gruppo amidico) agisce una amidotrasferasi che inserisce N-9, in questa reazione avviene un cambiamento della conformazione del C-1, infatti il PPi che α (ovvero sotto il piano dello zucchero) lascia il posto al gruppo amidico introdotto che si inserisce in β (sopra il piano dello zucchero), si ottiene così la 5-fosforibosil-b-ammina.

Nella reazione successiva entra la glicina che, in presenza di 1 ATP che fornisce energia dando ADP + Pi e dell’enzima glicinammide ribonucleotide sintetasi, forma la glicinammide ribonucleotide = GAR, in questo modo dopo l’N-9 abbiamo fatto entrare una glicina, quindi il C-4 e il C-5.

Nella reazione successiva entra un’unità carboniosa sottoforma di formil-tetraidrofolico. L’enzima è una GAR trasformilasi che trasferisce il formile dal formil-tetraidrofolico alla formilglicinammide ribonucleotide = FGAR.

Nella reazione successiva entra un’altra glutammina e fornisce un gruppo ammidico che viene trasportato dall’FGAM sintetasi in posizione 3 dell’anello in formazione (quindi entra l’N-3), la FGAM sintetasi quindi, utilizzando l’energia fornita dall’ATP, forma formilglicinammide ribonucleotide = FGAM.

Nella reazione successiva se ne va una molecola d’acqua con chiusura dell’anello e formazione della 5-aminoimidazolo ribonucleotide = AIR, ATP fornisce energia all’enzima AIR sintetasi che catalizza la reazione.

La reazione successiva è una reazione di carbossilazione attivata dall’ATP: entra una CO2 che porta il C-6 e si forma il 5-ammino-4-carbossimidazolo ribonucleotide = CAIR

Nella tappa successiva entra aspartato che, grazie all’energia fornita da ATP all’enzima SAICAR sintetasi, si lega al gruppo carbossilico presente in posizione 6 dell’anello purinico (à N-1), dunque se ne va una molecola d’acqua con formazione di un legame carbamidico, e si forma il 5-amino-4-succiniammide imidazolo.

Nella reazione successiva lo scheletro carbonioso viene staccato come acido fumarico da adenilosuccinato liasi, si forma allora il 5-ammino-4-carbossiammide imidazolo.

Interviene a questo punto un altro formil-tetraidrofolico che dona il C-2 della purina introdotto da AICAR trasformilasi come gruppo formilico, si forma quindi il 5-formilamido-4-carbossiammide imidazolo.

A questo punto se ne va un’altra molecola d’acqua, l’anello si chiude grazie all’inosina monofosfato sintasi che ciclizza questa molecola, si forma quindi la base purinica IMP che non è presente del DNA e nell’RNA e che è il punto di arrivo di questa via biosintetica.

Dall’IMP (inosina monofosfato) vi sono due strade possibili.

  • Interviene l’adenilosuccinato sintasi che, grazie all’energia fornita dal GTP, introduce l’N-6 donato dall’aspartato formando adenilosuccinato, l’adenilosuccinato liasi stacca lo scheletro carbonioso sottoforma di fumarato e si forma così l’AMP.
  • Intervene l’IMP-deidrogenasi NAD dipendente che introduce un gruppo chetonico in posizione 2 dell’anello formando XMP xantosina monofosfato, nella guanosina questo gruppo chetonico deve essere sostituito da un N, ed è la glutammina che, in presenza di ATP che cede energia alla GMP sintetasi, cede un NH2 allo XMP formando GMP.

 

Tappe di regolazione

  1. Fosforibosil trasferasi o sintetasi (che permette la formazione del 5-fosforibosil-pirofosfato):

inibito allostericamente dalle 3 basi puriniche, prodotti finali del processo: IMP, GMP e AMP

  1. Amidotrasefrasi (che permette la formazione della 5-fosforibosilammina):

stimolato allostericamente da 5-fosforibosil-pirofosfato

inibito allostericamente da IMP, GMP e AMP

La regolazione di queste ultime 2 vie è modulata, bilanciata affinché le 2 basi siano prodotte nella giuste quantità, infatti se manca una delle 2 basi o vi è un importante squilibrio si avrà un’errata sintesi di DNA e quindi si possono avere delle mutazioni.

Siccome l’adenilosuccinato sintetasi ha come substrato il GTP, se il GTP è in eccesso va a stimolare la produzione di AMP, e quindi sposta sintesi verso l’altro nucleotide che in quel momento è presente in quantità minore. La stessa cosa fa l’ATP in eccesso, che essendo substrato della GMP sintasi, sposta l’equilibrio della reazione di sintesi sul GMP. Se entrambi sono in eccesso vanno a inibire l’adenilosuccinato sintetasi bloccando completamente la sintesi delle purine. Vi è inoltre un ulteriore controllo: infatti il GTP quando si accumula va a stimolare la sintesi di AMP ma va anche a bloccare l’IMP deidrogenasi, e quindi inibisce la sintesi di altro GTP, così come l’ATP stimola la sintesi di GMP ma se si accumula va a inibire la sintesi di nuovo ATP à controllo incrociato.

Grazie a queste modalità di regolazione i nucleotidi purinici vengono prodotti in quantità sufficienti e adeguate (quando si ha un eccesso di uno dei 2 la sintesi è spostata sull’altro e viceversa mentre quando entrambi sono in eccesso è direttamente bloccata l’amidotrasferasi impedendo così la formazione di entrambi).

Amidotrasferasi: enzima presente sia in forma monomerica (attiva) sia in forma polimerica (inattiva), l’equilibrio fra queste due forme è spostato dai regolatori allosterici:

  • Aminopurine (IMP, GMP) e ossipurine (AMP) , che sono modulatori allosterici negativi, spostano equilibrio verso la forma polimerica inattiva
  • 5-fosforibosil pirofosfato, che è un modulatore allosterico positivo, sposta l’equilibrio verso la forma monomerica attiva.

Questo enzima avrà quindi 2 siti di regolazione, uno per le aminopurine e uno per le ossipurine.

L’amidotrasferasi ha un andamento di tipo sigmoide, i modulatori allosterici negativi fanno sì che la forma di questa curva sia maggiormente spostata verso destra, e quindi l’enzima alle stesse concentrazione di 5-fosforibosil pirofosfato diminuisce enormemente la sua attività catalitica.

La massima inibizione si avrà quando entrambi i siti di regolazione dell’enzima sono occupati, ovvero quando si è in una condizione di eccessiva concentrazione sia di aminopurine sia di ossipurine, infatti l’inibizione di queste basi è sinergica.

Per sintetizzare queste basi puriniche sono necessari dagli 8 ai 9 legami altamente energetici e dunque la sintesi di queste molecole rappresenta un costo notevole per la cellula. All’interno della cellula può però succedere che avvengano dei processi di degradazione dove questi nucleotidi sono incorporati. Le basi che si formano da questi processi, anziché essere eliminate, vengono riutilizzate. L’ipoxantina e la guanina, ad esempio, sono provviste di un enzima di recupero, l’ipoxantina guanina fosforibosil trasferasi, che in presenza di 5-fosforibosil pirofosfato riforma il nucleotide corrispondente evitando la via biosintetica vista fino a questo momento che abbiamo detto essere molto dispendiosa in termini energetici. Anche l’adenina può essere recuperata grazie all’enzima adenina fosforibosil trasferasi con lo stesso meccanismo d’azione: trasferimento dello zucchero del 5-fosforibosil pirofosfato sulla base in modo da formare i nucleotidi corrispondenti.

 

ACIDO FOLICO

Un’altra vitamina importante che entra in questi processi è l’acido folico, dove la parte funzionale è rappresentata dall’azoto 5 e dall’azoto 10 della molecola. Essendo una vitamina viene introdotta con la dieta, specialmente con la verdura a foglie larghe. La sua forma attiva è il tetraidrofolato, ciò significa che la forma di acido folico che noi assumiamo deve subire 2 successive riduzioni ad opera dello stesso enzima, la diidrofolato reduttasi, che a spese di 2 molecole di NADPH permette la formazione della vitamina funzionale. Questa vitamina serve per il trasferimento delle unità monocarboniose, ad esempio nella sintesi delle purine i carboni in posizione 2 e in posizione 8 dell’anello vengono drenati dal formiltetraidrofolico, oppure nella sintesi dell’acido deossitimidilico interviene sotto forma di N5-N10– metilentetraidrofolico.

Le unità monocarboniose trasportate possono essere a diverso livello di ossidazione:

  • sotto forma di metile avremo il metiltetraidrofolico con il metile legato all’azoto 5 dell’anello
  • sotto forma di formile legato all’azoto 5
  • sotto forma di formile legato all’azoto 10 (acido para-aminobenzoico)
  • sotto forma di metilene (N5-N10– metilentetraidrofolico)

Fenomeni di carenza: un diminuito apporto di questa vitamina determina un’anemia di tipo meganoblastico dove i globuli rossi sono più grossi del normale per una diminuita produzione dei nucleotidi che altera la produzione di DNA e RNA. Questi globuli rossi, più grossi del normale, una volta in circolo, vengono rimossi perché non vengono riconosciuti come normali.

SINTESI DEL dTMP (ACIDO DEOSSITIMIDILICO)

 

Avviene a partire dal dUMP, che è il substrato della timidilato sintasi. Il dUMP si forma a partire da dUTP ad opera della reduttasi, poi attraverso opportune trasformazioni diventa dUMP. Questo diventa il substrato della timidilato sintasi che in presenza del cofattore vitaminico N5-N10– metilentetraidrofolico dà origine al dTMP. Bisogna però osservare che quello che dobbiamo introdurre sul carbonio 5 dell’uracile non è un gruppo metilenico (CH2), ma un gruppo metilico (CH3). Di conseguenza, durante il trasferimento, la molecola di metilene viene ridotta a spese del tetraidrofolato, che si ossida così in diidrofolato. Quindi la vitamina interviene in due passaggi: in uno con il trasferimento del metilene, e nell’altro con la riduzione del metilene a metile, che è l’unità monocarboniosa, che dobbiamo inserire sull’anello per formare dTMP. Poi la vitamina diidrofolato, per continuare a ripetere la reazione, dovrà di nuovo essere ridotta dalla diidrofolato reduttasi, un’enzima NADPH dipendente, e poi dovrà ricaricarsi del gruppo metilenico che viene donato da una serina che si trasforma in glicina. Per questo procedimento è necessaria una serina tetraidrofolato metilen transferasi. La timidilato sintasi è molto importante perché è un bersaglio “ottimale” nelle chemioterapie perché impedisce la formazione del dTMP che dovrà essere inserito nel DNA, quindi una sua minor produzione riduce la proliferazione cellulare.

 

Esistono 3 tipi di farmaci antitumorali:

  1. antifolati
  2. antagonisti della glutammina
  3. antimetaboliti

Gli antifolati sono delle molecole con struttura simile a quella dell’acido folico che inibiscono la diidrofolato reduttasi (ad esempio il metotrexato) legandosi ad essa ed impedendo così la riduzione e la conseguente attivazione della vitamina tetraidrofolato. Ciò comporta una minor produzione sia di purine che di dTMP.

Gli antagonisti della glutammina (ad esempio azaserina, diazo-oxo- norleucina (DON)) sono molecole che hanno struttura simile alla glutammina. Essi vengono legati dagli enzimi che normalmente legano la glutammina. Ad esempio nella sintesi delle purine la glutammina dona l’azoto 3 e l’azoto 9, quindi blocchiamo la sintesi nella purine. Oppure la glutammina entra anche nella sintesi del CTP e così via. Quindi questi farmaci si sostituiscono alla glutammina che è il substrato fisiologico e bloccano la sintesi di queste molecole.

Gli antimetaboliti sono molecole con struttura simile alle basi puriniche e pirimidiniche che normalmente sono presenti nel nostro organismo.

Ad esempio il 5-fluorouracile viene utilizzato come substrato dagli enzimi di recupero che sono in grado di riformare i nucleotidi corrispondenti partendo dalle semplici basi. Quindi sostituendosi all’uracile normale può formare 5-fluoro-dUMP che interferisce con la timidilato sintasi bloccandola. Altri danni si hanno nella formazione dell’RNA, soprattutto nella maturazione dell’rRNA. Il problema delle chemioterapie è proprio questo, se sono efficaci provocano perdita di capelli, bruciori allo stomaco e all’intestino perché non vengono prodotti gli epiteli, ulcerazioni della pelle, perchè questi farmaci non vanno a selezionare solo le cellule tumorali, ma interferiscono con tutte le cellule in attiva proliferazione.

Un’altra molecola è la 6-mercaptopurina che differisce dalle altre purine per la presenza in posizione 6 del gruppo solfidrilico (SH). Questo farmaco viene riconosciuto dagli enzimi di recupero per cui si forma il nucleotide corrispondente, che se si accumula all’interno della cellula va ad inibire l’aminotransferasi, il primo enzima della sintesi delle purine. Il problema è che questa molecola viene riconosciuta anche dagli enzimi degradativi che portano al catabolismo di queste basi, di conseguenza viene eliminata molto velocemente. Per questo motivo può venire somministrata insieme all’allopurinolo che blocca il catabolismo della basi, allungando l’effetto del farmaco.

Un altro farmaco è l’idrossiurea che inibisce la ribonucleotide reduttasi. Esso agisce rimuovendo il radicale tirosinico e quindi impedisce l’attività dell’enzima.