Funzioni degli Enzimi

Le funzioni degli enzimi sono:

-OTTIMIZZARE LA RESA: avendo forte potere catalitico, accellerano una specifica reazione, sottraggono i substrati da altri destini, che potrebbero produrre molecole non necessarie o addirittura nocive

  • svolgere solo le funzioni necessarie
  • impedire reazioni indesiderate
  • portare a termine le reazioni in tempi brevi (certi enzimi fanno avvenire in un secondo quelle reazioni che senza la catalisi enzimatica avverrebbero in 10 giorni)
  • indipendenza dall’ambiente (temperatura, pressione)
  • riutilizzo della stessa “macchina” per molte volte, l’enzima non si consuma quando reagisce

 


-MINIMIZZARE GLI SPRECHI:

  • non produrre prodotti di scarto
  • minimizzare il dispendio energetico

Quasi tutte le trasformazioni chimiche degli organismi viventi avvengono in presenza di enzimi.

Grandissima parte degli enzimi sono proteine, ma non la totalità degli enzimi, alcuni sono degli RNA (ribozimi). Gli enzimi sono biocatalizzatori specifici capaci di innalzare la VELOCITA’ di reazioni termodinamicamente possibili, senza alterarne la costante di equilibrio. Gli enzimi non fanno avvenire reazioni che dal punto di vista termodinamico non sarebbero consentite, accelerano semplicemente la velocità con cui si raggiunge l’equilibrio, senza alterarlo.

La prima condizione che deve essere soddisfatta affinchè la reazione abbia luogo è che l’energia basale delle molecole che vanno incontro alla reazione sia superiore a quella posseduta dalle molecole che si producono nella reazione.

GR > GP

ΔG = GP – GR

Quando ΔG è negativo la reazione è ESOERGONICA e termodinamicamente SPONTANEA.

L’equilibrio tra R e P è una funzione della differenza di energia libera dei due componenti ai loro stati basali.

Se un equilibrio è favorevole (ΔG < 0) non significa però che la velocità della conversione da RàP sia elevata. La velocità della reazione dipende da un parametro completamente diverso, e cioè la capacità di superare la soglia di attivazione. ΔG non indica assolutamente la velocità della reazione, indica solo se dal punto di vista termodinamico la reazione può avvenire. Tra R e P esiste una BARRIERA ENERGETICA. Per far avvenire la reazione le molecole devono superare questa barriera e raggiungere un livello energetico più alto, in particolare questo punto viene chiamato STATO DI TRANSIZIONE.

Gli enzimi sono dei catalizzatori proteici (o almeno nella maggior parte dei casi, fatta eccezione per i ribozimi, che consistono in RNA con attività catalitica):

  • innalzano la velocità di reazione (la velocità cioè con cui una reazione va all’equilibrio), senza alterare l’equilibrio stesso
  • catalizzano diversi tipi di reazione in base a una maggior o minor specificità
  • possono agire catalizzando la reazione se è soddisfatta una condizione indispensabile: che l’energia basale delle molecole che vanno incontro alla reazione sia superiore a quella posseduta dalle molecole che si producono nella reazione
  • ciò significa che la reazione è ESOERGONICA, quindi spontanea, o meglio favorita nelle direzione in cui è scritta (l’equilibrio tra substrato e prodotto è una funzione della differenza di energia libera dei due componenti ai loro stati basali)
  • ma un equilibrio favorevole non vuol dire che la velocità di reazione è elevata: la velocità dipende dall’energia di attivazione (energia necessaria per raggiungere lo stato di transizione)
  • l’attività catalitica dell’enzima consiste nell’abbassamento dell’energia di attivazione:
  • Formando il complesso E-S (enzima-substrato)
  • Formazione del complesso E-P (in cui il prodotto è attaccato all’enzima)
  • Formazione del prodotto ultimo P (staccato dall’enzima)

Tramite la formazione di questi complessi intermedi l’energia necessaria per il raggiungimento dello stato di transizione viene a diminuire. In particolare poi si può definire lo STATO DI TRANSIZIONE come “instabile disposizione energizzata degli atomi in cui i legami chimici si formano e si rompono” ed inoltre la VELOCITA’ di una reazione chimica è proporzionale alla concentrazioni delle specie allo stato di transizione la differenza tra i livelli di energia dello stato di base e lo stato di transizione è detta “ENERGIA DI ATTIVAZIONE”: ad alti valori di energia d’attivazione corrispondono basse velocità di reazioni, mentre a bassi valori di energia, alte velocità esistono grazie ad un catalizzatore

  • esiste, però, un altro modo per superare l’energia di attivazione: SCALDANDO, fornendo, cioè energia dall’esterno, aumentando la temperatura aumenta l’energia iniziale delle molecole rendendo minore la differenza di energia con lo stato di transizione, MA GLI ENZIMI NON AGISCONO COSI’: con essi il superamento dell’energia di attivazione si ha in seguito alla formazione del complesso substrato-enzima, infatti la catalisi enzimatica stabilizza lo stato di transizione inserendo stati di transizione più bassi

Per svolgere la loro funzione gli enzimi hanno un “sito attivo” dove si va a collocare, con una perfetta corrispondenza geometrica, il substrato

La regione dell’enzima che interagisce direttamente con il substrato è proprio il sito attivo: le reazioni catalizzate dagli enzimi avvengono all’interno di una cavità, (detta sito attivo), in cui si crea un microambiente specifico che favorisce energeticamente reazioni che nell’ambiente cellulare sarebbero poco probabili, inoltre questo ha diverse caratteristiche:

  • parte relativamente piccola della molecola dell’enzima
  • tasca non polare, l’acqua viene infatti esclusa dal sito
  • il legame E-S avviene almeno in tre punti, avviene un riconoscimento tridimensionale (l’enzima riconosce anche se si tratta dello stereoisomero D o L), la complementarietà deve essere tridimensionale
  • crea interazioni multiple e non-covalenti con il substrato
  • mettono in posizione i residui con un principio chiave-serratura o adattamento indotto (in cui inizialmente non c’è una perfetta complementarietà, ma l’avvicinamento di substrato ed enzima induce questa complementarietà)
  • il sito attivo è costituito da un insieme spazialmente ordinato di residui di aminoacidi:
    • residui di contatto
    • residui catalitici
    • residui posizionanti (che dispongono il substrato in modo che i residui catalitici possano agire e catalizzare la reazione)
  • il sito attivo, in sè, è costituito da pochi aminoacidi, mentre il resto della struttura dell’enzima (che solitamente è molto complicata) serve a mettere in comunicazione i residui aminoacidici che sarebbero lontani nella molecola. In ogni caso, sia l’enzima che il substrato subiscono delle variazioni nelle loro strutture molecolari quando avviene il legame: avviene infatti anche una ridistribuzione di elettroni, che induce una tensione dei legami che prelude la rottura di alcuni di essi, ad esempio una variazione conformazionale dell’enzima esocinasi indotta dall’interazione con il substrato. Esso è l’enzima che introduce il glucosio nel metabolismo, in quanto catalizza la sua fosforilazione (trasferisce un fosfato inorganico dall’ATP al carbonio 6 del glucosio, creando così il glucosio-6-fosfato), esso modifica la sua conformazione quando è a contatto con il substrato. Un suo isoenzima è la glucocinasi, un enzima diverso ma che catalizza la stessa reazione.
  • l’enzima deve combinarsi chimicamente con il substrato, si formano dei legami ionici
  • inoltre una caratteristica degli enzimi è la loro specificità, che può essere:
    • assoluta = agiscono solo su uno specifico substrato
    • stereochimica = in cui avviene la distinzione dei due isomeri
    • di gruppo = agiscono tutte le volte che incontrano quel determinato gruppo (ad esempio la chimotripsina agisce ogni volta che incontra il gruppo della fenilalanina)
    • di reazione = agiscono tutte le volte che incontrano una determinata reazionegli enzimi agiscono sulle vie metaboliche: FORZANO le vie metaboliche attraverso reazioni selezionate, e favoriscono il flusso unidirezionale di materiale
  • gli enzimi spesso NON funzionano da soli, ma necessitano di una molecola NON PROTEICA, che può essere di vario tipo:
    • coenzima
    • cofattore (che può consistere anche in atomi singoli)
    • gruppo prostetico

infatti si parla di OLOENZIMA, cioè di un enzima che presenta anche un gruppo  prostetico/cofattore/coenzima attaccato: l’oloenzima è infatti composto da due parti dette APOENZIMA (che consiste nella parte puramente proteica, ad esempio nel caso dell’emoglobina corrisponde alla globina) e COENZIMA (che corrisponde alla parte non proteica, nel caso dell’emoglobina è il gruppo prostetico EME

I COENZIMI sono:

  • Fattori oligodinamici indispensabili (anche se in piccole quantità)
  • Piccole molecole organiche, spesso derivati da vitamine idrosolubili (B1, B2, B6, CoA, B12, C), scoperte con la teoria vitaminica di Hopkins del 1912
  • Si legano con forte affinità a enzima e substrato
  • Trasportatori di gruppi
  • Talvolta fungono da secondo substrato

Gli enzimi vengono classificati in classi:

  • OSSIDOREDUTTASI = che agiscono nelle reazioni di ossido-riduzione
  • TRANSFERASI = coinvolte nel trasferimento di gruppi chimici da una molecola all’altra
  • IDROLASI = agiscono nelle reazioni di idrolisi
  • LIASI = agiscono nelle reazioni di addizione ai doppi legami
  • ISOMERASI = agiscono nelle reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero
  • LIGASI = agiscono nelle reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o in ADP e Pi

FATTORI CHE CONTRIBUISCONO ALLA EFFICIENZA CATALITICA DEGLI ENZIMI:

  • Vicinanza e orientamento
  • Intermedio covalente
  • Catalisi acido-base: le molecole enzimatiche contengono molti gruppi funzionali capaci di agire come acidi e basi generali (nella loro forma protonata sono dei catalizzatori acidi e nella loro forma deprotonata sono dei catalizzatori basici), è infatti il catalizzatore che funge da accettore o donatore di protoni
  • Effetto del microambiente
  • Allineamento tra i gruppi funzionali
  • A volte si possono formare dei legami covalenti tra enzima e substrato che stabilizzano la struttura
  • Acqua di solvatazione da eliminare: le molecole d’acqua di solvatazione devono essere espulse perché destabilizzano la struttura, la desolvatazione aumenta l’energia del complesso rendendolo più stabile (le interazioni E-S sostituiscono la maggior parte dei legami a idrogeno che esistevano tra la molecola del substrato e H2O portando a una desolvatazione del substrato), inizialmente le molecole d’acqua, ordinate, del substrato e dell’enzima interagiscono tra loro, mentre i due si avvicinano quelle disordinate vengono staccate e sostituite da interazioni ioniche e idrofobiche e legami a idrogeno.

I principali fattori che influenzano l’attività di un enzima sono:

  • Il pH
  • La temperatura
  • La concentrazione dell’enzima
  • La concentrazione del substrato
  • La presenza di inibitori

Ogni enzima ha il suo pH ottimale che però può non corrispondere al pH dell’ambiente in cui si trova l’enzima, l’attività catalitica degli enzimi varia al variare del pH in modo diverso a seconda del tipo di enzima: ad esempio un enzima la cui attività enzimatica è maggiore a pH basico, aumenta sempre di più fino a un massimo, poi a pH acido ridiminuisce. Possiamo avere poi enzimi che sentono le variazioni del pH fino ad un valore di 7 o 8, poi rimangono indifferenti alle variazioni di pH, altri la cui attività enzimatica è maggiore a pH acido, altri ancora la cui attività enzimatica rimane sempre indifferente alle variazioni di pH.

 

A temperature basse, l’attività enzimatica rimane bassa, mentre cresce all’aumentare della temperatura. A temperature troppo elevate l’attività enzimatica cessa a causa  della denaturazione (rottura dei legami deboli e specialmente delle             interazioni idrofobiche).

La velocità (velocità iniziale, V0) aumenta in modo lineare rispetto alla concentrazione dell’enzima.

In una reazione chimica non catalizzata la velocità aumenta in modo lineare rispetto alla concentrazione del reagente ([S]), mentre in una reazione catalizzata da un enzima l’andamento dell’attività enzimatica è iperbolico e tende a raggiungere asintoticamente un livello massimo (Vmax)

  • L’andamento di questa funzione è descritta dall’equazione di MICHAELIS-MENTEN: questi due scienziati ipotizzarono che la curva fosse iperbolica a causa della formazione di un intermedio. affinchè si formi il prodotto si deve formare il prodotto E-S:

formula

  • In un primo momento l’andamento della funzione è quasi rettilineo (il che indica una proporzionalità diretta tra velocità e concentrazione del substrato), ciò perché le molecole di substrato non sono tante e l’attività dell’enzima è limitata (poca disponibilità di substrato)
  • Poi la disponibilità di substrato aumenta e la curva non mantiene più un andamento rettilineo, ma devia/curva, fino a raggiungere la saturazione
  • Si raggiunge la saturazione, la concentrazione di substrato aumenta fino a saturare completamente l’enzima (tutti i siti attivi sono contemporaneamente occupati dal substrato) ed in questo momento la velocità non può più essere aumentata ed è praticamente uguale alla Vmax, ogni enzima ha infatti la sua Vmax, che si può misurare in condizioni di saturazione

Sulla base di queste condizioni Michaelis e Menten ricostruirono l’equazione matematica:formula2

con Km = concentrazione di substrato per la quale si ottiene che la velocità è uguale a metà della Vmax

Un enzima, per svolgere al meglio il suo lavoro deve avere un Km bassa: deve poter sfruttare poco substrato per raggiungere subito una velocità elevata.

Ad ogni enzima-substrato corrisponde una Km caratteristica: essa è l’espressione dell’affinità dell’enzima per il substrato.

Tanto più piccolo è il valore di Km, tanto maggiore è l’affinità dell’enzima per il substrato, portiamo l’esempio di due isoenzimi:

  • L’ESOCHINASI nel muscolo ha una Km minore, cioè è più affine al glucosio, ed è capace di bloccarlo con maggior efficienza nella cellula
  • La GLUCOCHINASI nel fegato ha una Km maggiore, cioè è meno affine al glucosio, lo blocca cioè con minor efficienza, diventa un enzima attivo solo quando si raggiunge nelle cellule epatiche una concentrazione molto maggiore (rispetto alle cellule muscolari) di substrato

Volendo poi determinare la Km di un enzima che dà una curva molto ripida, l’operazione risulta difficoltosa, perché si rischia di approssimare troppo: per questo preciso scopo si usa la retta di LINEWEAVER-BURKE: curva che si ottiene con il metodo dei doppi reciproci dall’equazione di Michaelis-Menten:

si ottiene infatti una retta del tipo

Y = AX + B

L’attività enzimatica può essere modulata (anche se non tutti gli enzimi possono subire questo trattamento, come vedremo nelle vie metaboliche): esistono infatti alcune molecole (farmaci, sostanze tossiche) in grado di aumentare o inibire l’attività catalitica degli enzimi.

Questi composti si combinano con la molecola enzimatica in maniera reversibile o irreversibile, si parla infatti di:

  1. inibizione IRREVERSIBILE che consiste nella inattivazione definitiva di un enzima, di cui un esempio di inibizione irreversibile è quella operata dal gas nervino (diisopropilfluoro-fosfato), che si lega in modo covalente, e irreversibile, all’acetilcolina, inattivandola
  2. inibizione REVERSIBILE in cui gli inibitori reagiscono reversibilmente con l’enzima, e può essere di vario tipo:
    • COMPETITIVA: in cui l’inibitore compete con il substrato per il sito attivo, questo tipo di inibizione si verifica quando c’è una somiglianza strutturale tra substrato ed inibitore e quest’ultimo si posiziona nel sito attivo al posto del substrato: l’inibitore fa aumentare la Km ma può essere rimosso con l’aumento della concentrazione di substrato (e infatti possibile raggiungere la Vmax, che non viene modificata, ma a concentrazioni di S maggiori
    • NON COMPETITIVA: in cui l’inibitore si lega sempre in modo reversibile all’enzima, ma non in corrispondenza del sito attivo (non è mutuamente esclusivo il legame E-S o E-inibitore, ma possono esserci entrambi): l’inibitore (I) si può legare sia all’enzima libero, formando il complesso E-I, sia all’enzima con il substrato nel sito attivo, formando il complesso    E-S-I, questo tipo di inibizione non modifica la Km, ma abbassa la Vmax
    • INCOMPETITIVA: in cui l’inibitore si lega solo con il complesso E-S, formando il complesso E-S-I, questo tipo di inibizione porta ad una diminuzione sia della Km (abbassa la Km apparente), sia della Vmax