Effetto Bohr o Variazione del pH

Variazione del pH o effetto Bohr

Anche le variazioni del pH che si hanno nei vari punti del sistema circolatorio influenzano l’affinità all’O2 dell’emoglobina. Gli effetti di pH, CO2 e Cl (cloruro) sono strettamente collegati, in quanto nel sangue è la CO2 che modifica il pH, e che viene scambiata con il Cl all’interno dei globuli rossi.

Tutta questa CO2 è il prodotto finale del catabolismo, quindi tutti i tessuti ossidano ciò che introduciamo con la dieta per produrre energia che viene poi incamerata come ATP.

Le molecole a basso contenuto energetico che rappresentano il punto finale del catabolismo sono acqua e anidride carbonica, dato che non possono più fornire energia all’organismo sono due molecole di scarto di cui si deve privare.

La CO2 è riversata nel sangue e diffonde velocemente dentro ai globuli rossi dove si trova un enzima, l’anidrasi carbonica, che la trasforma in acido carbonico. L’acido carbonico dissocia subito in ioni H+ e ioni bicarbonato (HCO3). Ciò è fondamentale perché solo una piccola quantità dell’anidride carbonica prodotta può solubilizzarsi nel sangue. La quantità in eccesso andrebbe a formare bollicine che ostacolerebbero il flusso sanguigno (emboli).

L’effetto Bohr si può definire così: il legame con l’O2 favorisce il rilascio di protoni (H+) mentre l’aumento di protoni favorisce il rilascio di O2, infatti l’emoglobina ossigenata è un acido più forte dell’emoglobina non ossigenata.

Questa reazione avviene in un senso a livello dei polmoni, quando la pO2 (pressione parziale dell’ossigeno) è alta, dove i protoni vengono liberati dalle istidine e dai gruppi N-terminali delle catene peptidiche. A livello dei tessuti la pO2 è più bassa, si passa infatti da 100 mmHg nei polmoni a 40-30-20 mmHg nei tessuti.


Essi liberano anche CO2 che reagendo con l’acqua diventa acido carbonico, ma l’acido carbonico, dissociando in ioni H+ e ioni bicarbonato (HCO3), va ad aumentare uno dei prodotti della reazione (H+) e perciò l’equilibrio si sposta a sinistra, favorendo la liberazione dell’O2 da parte dell’emoglobina.

L’emoglobina a livello dei tessuti avrà tutte e quattro le subunità nella forma T (Tense), che ha bassa affinità per l’ossigeno. Quando questa arriva a livello dei polmoni, l’aumento di pressione parziale dell’ossigeno sposta la conformazione delle subunità verso la forma R. Quindi nel sangue arterioso l’emoglobina sarà in forma R, mentre nel sangue venoso sarà in forma T.

Riassumendo: quando l’emoglobina passa dalla forma T deossigenata alla forma R si ha un cambiamento della struttura quaternaria, dovuta alla rotazione dei due eterodimeri (formati ciascuno da una catena α e una β) che ruotano di 15° e slittano l’uno sull’altro, la chiusura della cavità centrale, l’avvicinamento delle catene β, la destabilizzazione di alcuni legami e la formazione di altri.

Durante questo passaggio alcuni gruppi (come l’istidina) modificano il loro pKa. Ad esempio: nella forma T l’istidina è legata ad un gruppo di aspartato, quindi la carica positiva dell’istidina è neutralizzata da quella negativa dall’aspartato, quando l’emoglobina si ossigena, il residuo di istidina si sposta (come alcuni altri residui amminoacidici) e si allontana dall’aspartato rendendo più facile la cessione del protone destabilizzato e quindi abbassando il pKa. Sembra che siano 38 le istidine coinvolte i questo processo, e anche i gruppi NH2 terminali partecipano (altri 4 protoni).

L’emoglobina ossigenata ha liberato dei protoni che si trovano sciolti nel sangue arterioso, e quando si arriva ai tessuti la CO2 che entra nei globuli rossi, viene trasformata in acido carbonico dall’anidrasi carbonica. L’acido carbonico (H2CO3) dissocia immediatamente in uno ione bicarbonato (HCO3) e un protone (H+) per sciogliersi in acqua.

Il protone così generato influenza l’emoglobina e sposta l’equilibrio della reazione di prima verso i reagenti (verso sinistra), favorendo perciò la liberazione dell’ossigeno.

Ciò raggiunge due scopi: liberare una maggiore quantità di ossigeno nei tessuti, ove necessario, e tamponare l’acidità prodotta dall’anidride carbonica trasformata in acido carbonico per il trasporto (cioè i protoni liberati dall’acido carbonico e che tenderebbero ad abbassare il pH del sangue sono legati dall’emoglobina). Infatti l’emoglobina è il sistema tampone organico più importante all’interno del sangue, a cui partecipano in misura minore anche altre proteine.

Ricapitolando a livello dei tessuti l’aumento della concentrazione di ioni idrogeno facilita la dissociazione di ossigeno dalla ossiemoglobina che diventa deossiemoglobina e procede a rimuovere gli ioni idrogeno facendo da sistema tampone del sangue.

  1. L’ossiemoglobina arriva ai tessuti con il sangue arterioso
  2. I tessuti producono CO2 che viene trasformata in acido carbonico dall’anidrasi carbonica
  3. L’H2CO3 dissocia protoni che determinano un aumento della dissociazione di ossigeno da parte dell’emoglobina (si lega all’idrogeno e libera ossigeno)
  4. In questo modo l’emoglobina porta ossigeno ai tessuti e tampona il pH del sangue
  5. L’emoglobina e lo ione bicarbonato ora sono nel sangue venoso che va verso i polmoni
  6. Nei polmoni una alta pressione parziale di ossigeno fa diventare ossiemoglobina la desossiemoglobina
  7. Essa libera i protoni che si legano allo ione bicarbonato, il quale (sempre catalizzato dall’anidrasi carbonica) ritorna CO2
  8. La CO2 viene liberata nell’aria all’interno dei polmoni, la quale verrà poi espirata

A livello dei tessuti:

  1. Entra l’anidride carbonica nei globuli rossi
  2. L’enzima anidrasi carbonica la trasforma in acido carbonico
  3. Esso dissocia e l’HCO3va nel plasma sanguigno
  4. L’emoglobina ossigenata si lega ai protoni (H+) dissociati dall H2CO3 e libera l’ossigeno

A livello dei polmoni:

  1. Entra l’ossigeno nei globuli rossi
  2. L’emoglobina libera protoni, cioè diventa un acido più forte
  3. Entra l’HCO3dal plasma che si lega ai protoni diventando H2CO3
  4. L’enzima anidrasi carbonica trasforma il H2CO3 in CO2 e H2O
  5. La CO2 viene liberata nell’aria ed espulsa con la respirazione

Durante un lavoro in mancanza di ossigeno la glicolisi nei muscoli procede con la fermentazione lattica, cioè viene prodotto acido lattico che causa un abbassamento del pH del sangue. Anche in questo caso c’è l’effetto Bohr, cioè l’emoglobina risponde con un maggior rilascio di ossigeno.

Quindi l’acidità a livello dei tessuti può essere data dall’acido carbonico o dall’acido lattico.

Dato che nei tessuti il pH è di solito più basso di quello che c’è nei polmoni, l’affinità dell’emoglobina è abbastanza dinamica. Quindi non posso utilizzare la stessa curva per indicare il grado di dissociazione della emoglobina: la curva a pH 7,6 è valida a livello dei polmoni mentre quella a pH 6,8 è valida nei tessuti muscolari in contrazione. Nel sangue venoso il l’HCO3 non può superare liberamente la membrana cellulare, quindi è presente un canale che permette il suo passaggio. Qui però c’è un antiporto, cioè per far uscire uno ione bicarbonato deve entrare uno ione cloruro.

Quindi a livello dei tessuti, quando l’acido carbonico passa nel plasma, uno ione cloruro entra nel globulo rosso, e l’opposto accade nei polmoni.

Tre modi per trasportare la CO2:

  • sciolta nel plasma (solo una piccola parte)
  • sotto forma di ione bicarbonato (la maggioranza)
  • trasportata come carboammato da estremità N-terminali e residui di lisina

 

Temperatura

Un aumento di temperatura diminuisce l’affinità per l’ossigeno della emoglobina, qui vale lo stesso discorso del pH nel muscolo: il muscolo sotto sforzo libera una grande quantità di calore che rende ancora maggiore il rilascio di ossigeno.

Dunque il muscolo sotto sforzo da una parte produce acido lattico, dall’altra fa aumentare la temperatura, e quindi il rilascio di ossigeno è aumentato da ben due fattori.

 

2,3Bisfosfoglicerato / 2,3Disfosfoglicerato

È un altro effettore allosterico negativo dell’emoglobina, è un glicerolo che ha in posizione 1 un gruppo carbossilico ed è esterificato in posizione 2 e 3 con due acidi fosforici. Si forma come reazione laterale della glicolisi: ad un certo punto del processo ossidativo del glucosio si arriva all’acido 1,3 difosfoglicerico. Se continuasse la glicolisi, l’alta energia di questo composto verrebbe utilizzata per formare ATP trasformandosi in 3-fosfoglicerato (3PG) che prosegue nella glicolisi. Nel globulo rosso, dove la glicolisi è particolarmente attiva, buona parte del 1,3difosfoglicerato subisce questa reazione laterale: l’enzima bifunzionale (sia attività mutasica che fosfatasica) 2,3DPG mutasi-fosfatasi trasferisce il gruppo fosfato dalla posizione 1 alla posizione 2 formando il 2,3-bisfosfoglicerato (o 2,3-DPG). Quando questa molecola non serve più perché cambiano le condizioni, interviene lo stesso enzima che stacca il gruppo fosforico dalla posizione 2 e ottiene il 3-fosfoglicerato che poi prosegue nella glicolisi.

Questa reazione collaterale è svantaggiosa: si perde la possibilità di formare una molecola di ATP. Anche se è inefficiente dal punto di vista energetico, questa reazione intermedia è talmente importante che nel globulo rosso avviene comunque.

Negli eritrociti la sua concentrazione è 5 millimolare, quasi la stessa dell’emoglobina, mentre nei tessuti la sua concentrazione è trascurabile.

Il 2,3-bisfosfoglicerato ha una struttura tale da inserirsi nella tasca centrale della emoglobina. Perciò avrà affinità per l’emoglobina in forma T, e non potrà legarsi alla emoglobina in forma R. Ciò perché la forma R ha la tasca più stretta della forma T. Si lega all’interno della camera grazie alle sue 5 cariche negative: una nel gruppo carbossilico e due in ogni gruppo fosfato. Nella tasca centrale dell’emoglobina queste cariche si legano a 8 cariche positive, tra cui i residui di istidina (anelli azzurri) un residuo di lisina (asta a zig-zag) e i residui terminali della catena (quelli con il numero 1).

Dato che il 2,3-bisfosfoglicerato stabilizza la emoglobina, quando esso è molto concentrato prevale la emoglobina in forma T e quindi diminuisce l’affinità della emoglobina per l’ossigeno.

 

Il 2,3-DPG è un intermedio della glicolisi: la via del glucosio all’interno del globulo rosso prende una deviazione importante perché viene a mancare un ATP nella via della glicolisi. È una via collaterale che porta alla formazione del 2,3-DPG, che una volta svolta la propria funzione viene ritrasformato nel 3-PG e prosegue la glicolisi. Il 2,3-DPG è particolare perché presenta 5 cariche negative, la sua concentrazione nei globuli rossi è molto più alta rispetto alle cellule normali, questo indica che all’interno di queste cellule svolge una funzione molto importante. Si inserisce all’interno della tasca centrale dell’emoglobina dove contrae dei legami di tipo ionico con le cariche positive che circondano questa tasca centrale. Queste cariche positive si trovano sulle subunità b, 4 da una parte e 4 dall’altra, si tratta di residui di istidina e lisina ed estremità N-terminali di catena. La presenza di queste 8 cariche positive stabilizza il 2,3DPG, che ha un’affinità alta per la deossiemoglobina, che è prevalentemente in forma T. Ciò avviene in quanto la cavità centrale è più ampia, quindi si lega ad essa stabilizzandola, l’ossiemoglobina, invece, è prevalentemente nella forma R, ed ha il canale centrale più ristretto dove esso si adatta meno facilmente.

Quindi la deossiemoglobina ha affinità minore per l’O2, perché viene stabilizzata dal 2,3DPG, rispetto all’ossiemoglobina. Ecco perché è un modulatore allosterico negativo dell’emoglobina.

È importante la formazione di questa molecola in situazioni particolari fisiologiche e patologiche dove la quantità di O2 che arriva ai tessuti diminuisce fortemente.

Più ci alziamo dal livello del mare, più l’aria diventa rarefatta e diminuisce la concentrazione di O2. Se diminuisce la concentrazione di O2 a livello dei polmoni l’emoglobina si può caricare meno, mentre a livello dei tessuti la pressione parziale di O2 rimane uguale. Quello che cambia quindi è lo scarto di pressione che c’è tra i polmoni e i tessuti, quindi varia la percentuale di saturazione dell’O2, che sarà inferiore a livello dei polmoni, mentre a livello dei tessuti la quantità che si libera è sempre uguale. Il risultato è che meno ossigeno viene liberato a livello dei tessuti. Per ovviare a questo problema viene sintetizzato in quantità maggiore il 2,3DPG, che stabilizza la forma non ossigenata, la forma T, e quindi a livello dei polmoni il cambio non è tanto perché la quantità di O2 è abbastanza alta, a livello dei tessuti invece diminuendo l’affinità per l’O2 viene liberata una quantità maggiore di O2.

La presenza di questo modulatore fa variare anche la P50 dell’emoglobina: se la P50 aumenta, diminuisce la quantità di O2 che viene liberata a livello dei tessuti.

Quando torniamo a basse altitudini la quantità di DPG diminuisce ritornando ai valori normali, perché questa molecola viene disgregata dalla fosfatasi, che rimuove il gruppo fosforico, si forma il 3PG, che prosegue nella glicolisi. Queste modificazioni avvengono velocemente, cioè man mano che saliamo di altitudine, si forma più DPG. Però se rimaniamo a queste altezze per del tempo, si ha un adattamento maggiore dovuto ad un aumento dei globuli rossi e della sintesi di emoglobina al loro interno.

Quindi ci sono

  • adattamenti precoci rappresentati dal modulatore negativo 2,3-DPG, che aumenta la sua concentrazione
  • adattamenti più a lungo termine, che sono rappresentati da un aumento dei globuli rossi e da un aumento della concentrazione di emoglobina

Il comportamento dell’emoglobina purificata, l’emoglobina denudata, che non presenta modulatori allosterici, che sono presenti all’interno del sangue, è diverso rispetto a quella non denudata: presenta una P50 più bassa, cioè una maggiore affinità per l’O2.

In laboratorio è stato controllato il comportamento quando si aggiungevano gradualmente i modulatori che influivano sull’affinità dell’emoglobina per l’O2: la curva si sposta da sinistra a destra aggiungendo prima singolarmente e poi contemporaneamente CO2 e 2,3-DPG, modulatori negativi, cioè diminuisce la P50 e l’affinità per l’O2.