DNA ricombinante

Il dna ricombinante si può definire come DNA artificiale, ma in modo più specifico come un legame tra un filamento di DNA vettore in cui viene inserito un filamento di DNA inserto, a livello di molecole di DNA che possono appartenere sia a cellule procariotiche che eucariotiche.

Questo DNA ricombinante particolare viene prodotto attraverso tecnologie che vengono definite essenzialmente come ingegneria genetica, fondamentalmente in due passi. Il primo metodo è dato da nucleasi specifiche, che sono gli enzimi di restrizione, i quali hanno la capacità di tagliare corte e specifiche sequenze di DNA, chiamate sequenze palindromiche, a livello di particolari siti di restrizione, che possono essere estremità piatte (o chiamate anche estremità “blunt”) o coesive (aventi solitamente un’estremità 5′ protrusivo e un’estremità 3′ recessivo), poi per cucire queste particolari sequenze di DNA si usa la DNA ligasi, in definitiva possiamo dunque dire che sia il vettore (solitamente un plasmide) che l’inserto vengono prima modellati dagli enzimi di restrizione per poi essere legati assieme dalla DNA ligasi.

Se il DNA ricombinante viene introdotto nelle cellule procariotiche, allora si parla di trasformazione batterica, mentre se viene introdotto nelle cellule eucariotiche (a parte nel lievito dove si parla sempre di processo di trasformazione) si parla di trasfezione. Se al posto di plasmidi utilizziamo come vettori dei virus, allora si parla di infezione o trasduzione genetica.

Il DNA ricombinante può essere introdotto anche in cellule staminali embrionali o addirittura anche nello zigote, per ottenere una sovraespressione di un inserto genico, ed in questa maniera si ottiene un animale transgenico, mentre si può anche andare ad inattivare un gene facendolo esprimere di meno, solitamente attraverso il principio di ricombinazione omologa, facendo in modo che il gene in questione venga sostituito da una variante mutata dello stesso gene o da una sequenza spaziatore, ed in questo caso si parla di animale knock-out. Abbiamo parlato di animali perchè solitamente questo tipo di esperimenti viene fatto su topi o polli, in modo da ottenere organismi geneticamente modificati, ma in forme di vita più semplici e più piccole posso andare anche ad ottenere dei microrganismi geneticamente modificati.

Possiamo suddividere il vettore in due categorie, ovvero in un vettore di clonaggio, che non porta alla sintesi del gene, ma lo veicola e basta, per isolare e caratterizzare meglio una particolare sequenza di DNA da studiare, oppure si può parlare anche di vettore di espressione, che invece porta direttamente all’espressione della sequenza genica da noi considerata.

Il vettore di clonaggio si utilizza in particolare nelle librerie genetiche, che vengono definite in librerie genomiche o in librerie a cDNA. Nel primo caso abbiamo che frammenti genici ben definiti tagliati attraverso un enzima di restrizione specifico per quello che vogliamo ottenere (bisogna infatti stare attenti a non creare dei filamenti troppo lunghi o troppo corti, in modo da non andare ad intaccare in maniera importante la componente genica del genoma, in ogni caso possono essere usati anche più enzimi di restrizione), poi inseriti nel vettore di clonaggio, solitamente rappresentato da un plasmide, ed ognuno di essi sarà poi integrato in una colonia batterica (questo processo di specificità può essere attuato attraverso delle caratteristiche specifiche di ogni plasmide, che può permettere la sopravvivenza al batterio che lo trasporta, come possono essere ad esempio delle resistenze agli antibiotici, con quest’ultimi che vengono posti nel terreno di coltura delle cellule batteriche) che verrà fatta proliferare, in modo che si arrivi ad ottenere una libreria genomica formata da diverse colonie batteriche, ciascuna formata da un clone batterico trasformato da un unico tipo di vettore. Nel secondo caso la procedura è analoga, solo che questa volta non si parte da tutto il genoma ma dagli RNA messaggeri, per arrivare a formare attraverso la trascrittasi inversa un filamento di cDNA che verrà poi reso a doppio filamento. È importante non confondere le librerie genomiche, che corrispondono a tutto il genoma di uno specifico organismo, con le librerie a cDNA che rappresentano solo la porzione codificante di un determinato organismo, quindi solamente circa l’un per cento del genoma, infatti le dimensioni delle due librerie sono sempre molto sproporzionate a favore della libreria genomica. Se vogliamo operare invece uno screening di queste librerie, innanzitutto su ogni piastra batterica andiamo a adagiare una matrice solida, come può essere una membrana di nylon, in modo che le cellule si trasferiscano a questo livello, poi vengono a questo livello lisate le cellule e denaturato il DNA, per deproteinizzarlo e legarlo così irreversibilmente alla matrice in cui sono presenti numerose cariche positive. A questo punto andiamo ad ibridare questa matrice solida con una sonda molecolare radioattiva complementare al nostro DNA di interesse, solitamente in una soluzione, effettuo un lavaggio sulla membrana per eliminare la sonda molecolare in eccesso che non si è legata e posso finalmente vedere se è presente in questo clone la sequenza di DNA da me ricercata, attraverso la tecnica dell’autoradiografia.

Queste sono comunque tutte applicazioni conoscitive, mentre ora vediamo che ci sono anche delle applicazioni più applicative, soprattuto in campo terapeutico.

Un vettore di espressione ha anche importanti applicazioni terapeutiche, ad esempio in ambito farmacologico, andando a far esprimere ad esempio ormoni e fattori di crescita come possono essere l’insulina e l’eritropoietina, oppure un’altra applicazione terapeutica molto importante è la terapia genica, che ci permette di ripristinare una funzione genetica perduta, ad esempio quando ci troviamo di fronte a pazienti affetti da una malattia genetica ereditaria, ma quest’applicazione può essere anche utilizzata per aggiungere nuove funzioni alle cellule, anche se questo è un processo molto più complicato e piuttosto lontano dalla fisiologia cellulare. Per operare questo tipo di tecnica si utilizzano solitamente dei vettori virali, ovvero dei virus modificati, che si caratterizzano per avere il gene virale sostituito con il gene terapeutico, inoltre hanno la caratteristica della patogenicità bloccata. Essi possono agire in vivo, quindi direttamente sul paziente, oppure si dice che agiscono ex vivo quando colpiscono le cellule del paziente che però sono state messe in coltura ed isolate dall’organismo, questo ad esempio è fatto per prevenire la pericolosità (intesa come possibile patogenicità) di alcuni vettori virali. Tra questi vettori virali citiamo quelli più utilizzati, ovvero gli oncoretrovirus, appartenenti alla grande categoria dei retrovirus, che danno origine ai vettori oncovirali, i quali sono per lo più utilizzati quando dobbiamo indurre un’integrazione permanente di un gene nel genoma della cellula bersaglio, quindi quando è richiesta la persistenza e l’espressione a lungo termine del gene trasferito. Poi abbiamo i lentivirus (tra cui citiamo l’HIV), che danno origine ai vettori lentivirali (appartenenti sempre alla categoria dei virus retorvirali anche se sono un po’ diversi), che a loro volta si caratterizzano per penetrare attivamente la membrana nucleare, quindi sono in grado di permettere la trasduzione di cellule quiescenti, come possono essere cellule terminalmente differenziate o cellule staminali. Citiamo anche i vettori adenovirali (derivati dall’adenovirus umano, un virus a DNA) e i vettori adenoassociati (derivano dal virus adeno-associato umano, ovvero un parvovirus che necessita di proteine prodotte dall’adenovirus per il proprio ciclo vitale), che invece sono adatti a far esprimere un gene per un momento temporaneo, soprattuto nei tessuti post-mitotici.

Se vogliamo fare un esempio del comportamento di questi vettori virali, possiamo prendere in considerazione il Moloney Murine Leukemia Virus (indicato anche con la sigla MoMuLV), che è il tipico esempio di retrovirus che viene fatto in ambito didattico. Abbiamo già comunque in ogni caso descritto come fa un retrovirus a infettare una cellula ospite nel capitolo sul DNA ripetitivo, quindi sottolineiamo come in particolare questo tipo di virus si comporta in un applicazione di terapia genica. Esso viene costruito rimuovendo tutti i geni virali, vengono solamente lasciate le sequenze non codificanti necessarie per l’integrazione e l’espressione del transgene (integrato sottoforma di cDNA), ovvero le regioni LTR, i segnali di splicing e il segnale d’incapsidamento necessario per l’incorporazione del gene nei virioni infettivi, infatti il segnale di poliadenilazione è contenuto nella regione LTR al 3′. Questo tipo di vettore viene generalmente replicato in particolari cellule “packaging”, ovvero linee di fibroblasti di topo in grado di fornire tutte le proteine virali necessarie per la formazione dei virioni, in quanto gli stessi geni virali sono stati integrati in questo tipo particolare di cellule, esse però sono costruite in modo che ci sia una minima possibilità di ricombinazione genetica tra il vettore ed i geni di origine virale, che potrebbe portare alla formazione di un virus competente per replicazione. Quello che abbiamo appena detto vale in particolare per i retrovirus, ma vale anche per le altre categorie di vettori che abbiamo citato in precedenza, se ci sono infatti delle differenze, queste sono veramente minime in questo tipo di processo. Successivamente questi vironi, caratterizzati dalla presenza di proteine in superficie che medieranno il rapporto con le cellule bersaglio da andare a curare, porteranno il gene in questione a livello proprio delle cellule bersaglio, ed una volta integrato nel loro genoma ci sarà l’espressione di questo stesso filamento a cDNA.