Analisi del DNA

Parliamo innanzitutto dei METODI DI ANALISI, in particolare per analizzare i cromosomi ed individuare in essi eventuali anomalie si ricorre all’analisi cariotipica, attraverso l’analisi dei cromosomi mitotici. Per analizzare invece i cromosomi interfasici, come abbiamo già visto, si può ricorrere all’ibridazione in situ con l’utilizzo di sonde molecolari fluorescenti che verranno poi illuminate da un fascio di raggi ultravioletti. Tutte queste metodiche hanno uno scopo conoscitivo-investigativo, ma possono anche avere uno scopo diagnostico e applicativo, tuttavia volendo fare un analisi non già a livello cromosomico, ma a livello dei geni, per studiare DNA, RNA o proteine, si deve ricorrere ad altre tecniche.

Per analizzare il DNA si può praticare una elettroforesi su gel di agarosio, un metodo abbastanza grossolano che serve ad analizzare in modo diretto pochi frammenti di DNA molto rappresentati, mentre all’analisi di Southern Blot si ricorre in particolare se i geni che si vogliono studiare non sono così rappresentati o sono comunque frammisti ad altri geni. Possiamo, con questa tecnica, studiare una delezione genica, perché consente di visualizzare in modo diretto un gene, quindi misurare la sua lunghezza, visto che con gli enzimi di restrizione possiamo scindere un gene dal contesto cromosomico in cui si trova, tagliando a monte e a valle con uno specifico enzima di restrizione, possiamo poi visualizzare la banda a noi interessata con una sonda molecolare e misurarne la lunghezza per confronto con il marcatore di peso molecolare da noi utilizzato. Dal punto di vista diagnostico possiamo perciò valutare se una sequenza, per esempio virale, è presente, possiamo capire se c’è una delezione genica (misurando un gene ci accorgiamo che è più corto del previsto), oppure possiamo capire se c’è un riarrangiamento genico come quelli che si accompagnano alle traslocazioni cromosomiche. Dall’analisi quantitativa della banda, cercando di quantizzare l’intensità della banda quindi, possiamo capire se c’è una amplificazione genica che è un possibile meccanismo di attivazione di protoncogeni in oncogeni, infatti se l’intensità della banda è aumentata, significa che c’è stato questo tipo di meccanismo, mentre la delezione è invece un tipico meccanismo di inattivazione degli antioncogeni. Spesso di fronte a tumori del sistema linfatico, grazie alla tecnica di Southern Blot riesco infatti a fare una diagnosi di appartenenza di linea, riesco a capire cioè se il linfoma è di tipo B o di tipo T, valutando se il tessuto tumorale presenta il riarrangiamento clonale del recettore dei linfociti T o delle immunoglobuline.

Se vogliamo invece andare ad analizzare l’RNA, una importante tecnica di analisi dell’RNA è la Northern Blot (quella delle proteine è chiamata invece Western Blot, perchè colui che inventò la tecnica di analisi del DNA si chiamava Southern, dopodichè le altre tecniche di analisi sono state chiamate Northern e Western). In questa tecnica viene estratto l’RNA totale dalle cellule dopo aver provocato la lisi delle stesse cellule, l’RNA è sottoposto così a separazione elettroforetica su gel di agarosio. Si osservano a questo punto su gel tre bande, che corrispondono all’RNA ribosomale 28S, al 18S e agli RNA ribosomali 5S e 5,8S che migrano insieme. Tra la banda degli rRNA a 28S e quella degli rRNA a 18S si intravede una debolissima striscia, che secondo alcuni è RNA poliadenilato, mentre secondo altri rappresenterebbe DNA degradato. L’RNA separato mediante l’elettroforesi su gel, per essere studiato più accuratamente deve poi essere trasferito su una membrana di nylon, proprio come nella tecnica Southern Blot, per poi essere ibridato con una sonda molecolare radioattiva, in modo che l’RNA da noi cercato possa essere visibile attraverso un’autoradiografia. Lo scopo della tecnica Northern Blot è quello di fornire indicazioni sull’espressione genica, a livello dell’RNA messaggero, per capire se un determinato gene è iperespresso o ipoespresso, in particolare questo ha una finalità diagnostica dato che, come sappiamo, l’amplificazione genica di un protoncogene si accompagna all’iperespressione del corrispondente RNA messaggero.

Per quanto riguarda invece la tecnica del DNA microarray, vediamo che rappresenta una metodica molto sofisticata, diversa dalle precedenti, infatti fino ad ora abbiamo analizzato tecniche in cui la sonda molecolare veniva posta in soluzione mentre il campione dell’acido nucleico da analizzare era localizzato su un supporto solido. Nella tecnica del DNA microarray invece si mettono molte sonde molecolari su un supporto solido, in particolare si procede ad ancorare, ovvero a depositare un numero elevato di sonde molecolari all’interno di aree circoscritte sul supporto solido, che viene poi messo a contatto con il campione da analizzare. Tutto questo si fa in un sistema miniaturizzato, in una superficie di un cm2 dove possono essere depositate sonde molecolari anche per tutti i geni del genoma umano. Con la tecnica del DNA microarray, è possibile studiare sia il DNA che l’RNA, comunque l’applicazione prevalente è quella sullo studio del RNA, in particolare l’acido nucleico che viene analizzato viene marcato grazie a un fluorocromo, mentre nelle tecniche precedentemente descritte si usavano segnali radioattivi, questo comporta dunque oltretutto una maggiore sicurezza nell’esperimento e una maggiore facilità di utilizzo dei componenti.

La PCR (detta anche reazione polimerasica a catena) è una tecnica che riesce ad amplificare in modo selettivo e specifico una determinata sequenza genica, in particolare questa metodica presenta un’elevata sensibilità in quanto è in grado di analizzare anche tracce di acidi nucleici. L’amplificazione è condotta con diversi cicli ripetuti di questa reazione, ad esempio all’interno di ogni ciclo la sequenza bersaglio viene prima denaturata col calore, a una temperatura tra i 90 e i 100 gradi centigradi, si procede poi all’appaiamento dei due inneschi (i due filamenti complementari di DNA che fanno da stampo) che sono stati precedentemente disegnati e sintetizzati, ad una temperatura inferiore di quella precendete, e si allungano gli inneschi, così ad ogni ciclo di reazione si raddoppiano il numero di molecole di partenza, ripetendo dunque tante volte il ciclo di reazione ottengo l’amplificazione della sequenza di partenza. Sul DNA con la PCR è possibile studiare mutazioni puntiformi, amplificando prima la sequenza di DNA e procedendo poi a sequenziarla, si possono inoltre studiare delezioni geniche e riarrangiamenti cromosomici. Ci accorgiamo per esempio di una delezione genica se, andando a studiare la forma genica a noi interessata e la stessa forma genica nella sua forma “wild type”, vediamo che otteniamo un amplificato più corto dell’altro, perché vi mancano alcune sequenze. Per individuare invece mutazioni puntiformi si amplifica la sequenza di interesse, poi la si sottopone a sequenziamento, perciò qui non basta la sola tecnica della PCR per poter trovare le nostre conclusioni. Si possono però studiare anche le traslocazioni con la PCR, ad esempio ponendo un innesco su uno dei due geni che partecipano alla fusione e l’altro innesco sull’altro gene, in condizioni di normalità non si forma l’amplificato perché i due geni si trovano in siti distinti, su due cromosomi diversi. Per amplificare una regione di DNA in PCR infatti sono invece necessari due inneschi posti a monte a e a valle della regione stessa, perciò quando avviene la traslocazione cromosomica il sito è il medesimo e si ottiene l’amplificato.

Si può studiare l’RNA con la PCR procedendo all’estrazione dell’RNA da una cellula e trascrivendolo con la trascrittasi inversa, una RNA polimerasi DNA dipendente utilizzata, come sappiamo, anche dai retrovirus per trascrivere il proprio genoma fatto di RNA, in DNA per poi integrarlo nei cromosomi della cellula ospite. Come tutte le polimerasi, la trascrittasi inversa richiede un innesco, si usa infatti a tale scopo l’oligoDT, un frammento di DNA che contiene solo timine (infatti rappresenta una sequenza complementare alla sequenza poliA dell’mRNA, perciò è perfetto come innesco), si aggiungono i deossinucleotidi trifosfati e la trascrittasi inversa, si inserisce il tutto in un tubicino e si sintetizza il cDNA, ossia il DNA copia dell’RNA messaggero, poi ci si libera dell’RNA messaggero stesso. La logica vorrebbe che ora il cDNA a singola catena venisse convertito in un DNA a doppia catena, attraverso la sintesi del suo filamento complementare, ma che bisogno c’è di fabbricare la seconda sequenza di DNA? Possiamo infatti andare direttamente avanti con la tecnica della PCR, in particolare nel primo ciclo della PCR viene sintetizzata la catena complementare al cDNA e dal secondo ciclo in avanti comincerà una PCR regolare. Riepilogando, per studiare gli RNA messaggeri si ricorre a questo trucco, ovvero si estrae l’RNA totale di una cellula, si retrotrascrivono tutti gli RNA messaggeri con l’ausilio di frammenti di nucleotidi esclusivamente timinici che fanno da base per l’attività della trascrittasi inversa, poi ci si libera dell’mRNA, a questo punto il cDNA viene amplificato direttamente dalla PCR. La variante della tecnica PCR appena descritta si chiama RT-PCR (Reverse Transcription PCR), ovvero indica una PCR preceduta da una trascrizione inversa.

Per operare invece la tecnica del SEQUENZIAMENTO, si utilizza il cosiddetto metodo di Sanger che prevede sostanzialmente un elettroforesi su gel, ma non di agarosio, bensì di poliacrilammide (questa tecnica viene indicata con la sigla PAGE), infatti questo polimero differisce dall’agarosio perché consente la separazione di frammenti molto più piccoli di DNA, che differiscono tra loro anche solo per un nucleotide. In questa tecnica si fa avvenire una sintesi di DNA in quattro distinti comparti di DNA e la si fa arrestare, in maniera specifica, a livello di ognuna delle 4 basi che esistono nel DNA, si allestiscono in pratica 4 reazioni e la prima viene stoppata per esempio a livello di tutte le adenine, la seconda a livello di tutte le citosine e le altre due reazioni vengono fatte arrestare ognuna su tutte le basi azotate dei due tipi rimanenti, queste quattro reazioni sarebbero quindi identiche se non fosse che cambia il nucleotide in prossimità del quale il processo viene arrestato. In ognuno dei quattro tubi dove avvengono le reazioni si inserisce lo stampo (rappresentante il vero filamento di DNA che vogliamo sequenziare), un innesco specifico complementare allo stampo, una DNA polimerasi e dei deossinucleotidi trifosfati, insomma tutto quello che serve per operare una sintesi di DNA. Ciò che varia tra un tubo e l’altro è l’inserimento di un composto chiamato dideossinucleotide, il quale esiste per ciascuna delle quattro basi azotate, c’è quindi un dideossinucleotide per ciascuno dei 4 tubi. I deossinucleotidi del DNA convenzionali sono privi di un gruppo idrossilico in posizione 2’, ma i dideossinucleotidi, invece, mancano di un gruppo idrossilico anche in posizione 3’ (questo dideossinucleotide solitamente viene marcato sul fosfato prossimale al ribosio con un radioisotopo, per poter recuperare i dati dalla nostra analisi, in particolare si usa un fosforo radioattivo, chiamato fosforo 32, che è un β-emittente (ovvero emette elettroni), e si caratterizza per essere uno dei radioisotopi meno pericolosi in circolazione), e questo ha grosse conseguenze sulla sintesi del DNA, infatti un dideossinucleotide infatti può essere legato, durante la sintesi di DNA, al nucleotide che si trova a monte perché presenta il gruppo fosfato al 5’, ma a questo punto la sintesi si arresta perché mancando il gruppo idrossilico al 3’, il nucleotide a lui successivo non può essere aggiunto, ricordiamo infatti che la sintesi del DNA procede in direzione 5′-3′. In ultima analisi, nei quattro tubi che ospitano le quattro diverse reazioni vengono aggiunti diversi dideossinucleotidi, in particolare stiamo parlando di ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, così si avrà l’arresto a livello del dideossinucleotide incorporato in ciascuna di queste quattro reazioni, però essi devono essere posti a concentrazioni minori rispetto alle concentrazioni in cui sono presenti nello stesso tubo i nucleotidi convenzionali, questo per un concetto di tipo probabilistico, infatti in questa maniera viene facilitato l’arresto della sintesi del DNA anche verso la fine del filamento stampo. A questo punto le aliquote vengono caricate su quattro corsie elettroforetiche, che considerate assieme permettono di vedere dal frammento più corto (migrato più in basso nel gel di poliacrilammide per il principio di base con cui funzionano le elettroforesi) al frammento più lungo quale nucleotide viene di volta in volta aggiunto sul 3′ del filamento neosintetizzato, quello più corto è migrato più in basso per il gel, per il principio di base dell’elettroforesi, e in questo caso possiamo benissimo risalire a queste conclusioni attraverso un’autoradiografia, vista la precedente marcatura radioattiva del fosfato prossimale al ribosio nei dideossinucleotidi.

Ai giorni nostri si è introdotta però la PCR, in modo che la regione del DNA che vogliamo andare a sequenziare venga prima amplificata, poi il sequenziamento stesso viene effettutato con una PCR, ovvero con un amplificatore termico utilizzando solamente un innesco, si parla dunque di PCR modificata. Sono stati inseriti anche quattro fluorocromi da aggiungere ai quattro dideossinucleotidi trifosfato, con quattro diverse luci colorate, in modo che l’identificazione della sequenza di DNA da noi studiata sia ancora più facile, questa volta grazie ad una migrazione elettroforetica con le aliquote riunite, ed in base al colore che viene emesso e rilevato dal passaggio dei vari filamenti di DNA attraverso una finestra d’analisi, possiamo con un sensore che emette una luce ultravioletta rilevare il segnale del fluorocromo e inviarlo al computer, dove si forma l’elettroferogramma. In questo caso vengono costruiti picchi in successione con quattro diversi colori che mi permettono sull’asse orizzontale di segnare le basi azotate di questa sequenza di DNA, anche se si possono verificare delle situazione anomale, ad esempio in un unico sito nucleotidico ci possono essere due picchi, di cui uno era atteso e l’altro no, ed allora si parla di condizione eterozigotica dell’individuo, mentre se è presente a livello di un sito nucleotidico un unico picco non atteso, allora si parla di una mutazione che ha portato alla condizione di omozigosi.

Per fare questo tipo di esperimenti si utilizzano solitamente cellule facilmente recuperabili, quindi solitamente si parla di un campione di sangue periferico, mentre nel feto invece questi test possono essere fatti sugli amniociti, circa al quarto mese di gravidanza, per analizzare eventuali anomalie cromososmiche o la diagnosi prenatale di malattie genetiche, ma sempre con lo stesso obiettivo questo esperimento può essere fatto sui villi coriali a livello della placenta, più o meno al secondo mese di gravidanza.