Sintesi proteica dei ribosomi

La sintesi dei ribosomi è un processo molto complicato, prevede infatti la formazione di rRNA e delle proteine che si devono associare ad esso, chiamate proteine ribosomali, in tutto più di 100, tutto questo processo deve però essere sincronizzato (ovvero la formazione degli rRNA ribosomali e la trascrizione e la traduzione delle proteine ribosomali), altrimenti il processo stesso sarebbe del tutto insufficiente, a differenza delle cellule tumorali dove questi ribosomi sono già stabili. Le sequenze di trascrizione degli rRNA sono contenute nella regione fibrillare del nucleolo, che daranno poi origine ad una subunità maggiore (60 S) ed una subunità minore (40 S), misurate con una particolare unità di misura (Svedberg) che tiene conto della velocità di sedimentazione della particella durante il processo di centrifugazione. Questi ribosomi possono lavorare assieme, si dice che lavorano in filiera, per lavorare in maniera più efficiente si accoppiano a livello di un RNA messaggero, che oltre alla sua forma circolare si ritroverà pieno di ribosomi che contribuiranno a migliorare la sua traduzione e si andrà a formare un complesso chiamato polisoma. Avremo dunque diversi ribosomi che percorreranno tutta la struttura circolare del mRNA per poi arrivare a dissociarsi all’estremità 3′ dello stesso mRNA, ma vista la circolarità del RNA messaggero possono anche tornare ad associarsi subito all’estremità 5′, andando a migliorare in maniera molto importante l’efficienza della traduzione di questo stesso mRNA. Tutti questi ribosomi sono liberi nel citosol, poi attraverso un particolare sistema di trasporto migrano sul reticolo endoplasmatico conferendogli quella caratteristica rugosità, in particolare qui verranno sintetizzate solo proteine secretorie (ad esempio ormoni, citochine, proteine della matrice extracellualre, albumine, caseina, lattoalbumina, tripisna, chimotrispina o amilasi, in generale sono più di 1000), ovvero quelle proteine che sono destinate all’esterno della cellula, sulla membrana cellulare o nei lisosomi, mentre le proteine citoplasmatiche sono destinate al nucleo, ai mitocondri o ai perossisomi. Ma come fanno a sapere dove devono andare queste proteine? Ci sono dei particolari segnali che dicono alle proteine dove devono andare, e sono stati studiati per ogni specifica localizzazione, attraverso infatti esperimenti di mutagenesi (abbiamo provato attraverso mutazioni a modificare particolari sequenze geniche e abbiamo visto cosa succedeva) abbiamo trovato diverse indicazioni, in particolare per il reticolo endoplasmatico ci sono dai 6 ai 12 amminoacidi idrofobici sull’N-terminale che formano un peptide segnale, sono ad esempio queste le sequenze leader per le immunoglobuline, per i mitocondri si parla invece di un segnale anfipatico costituito in tutto da 18 amminoacidi, che vanno a formare una porzione di amminoacidi idrofili e idrofobi all’N-terminale presenti sulle due superfici opposte di una struttura ad α-elica, per le proteine nucleari invece si parla di LNS (Localization Nuclear Signal), ovvero uno o due tratti (possono essere ripetuti con l’interposizione di 12 amminoacidi non basici) di amminoacidi carichi positivamente formati da 5 amminoacidi basici, ed è un segnale interno alla proteina, mentre le proteine destinate ai perossisomi hanno una serina, una lisina e una leucina al C-terminale.

Andiamo ora ad analizzare la PATHWAY SECRETORIA, che permette di formare le cosiddette proteine secretorie, ovvero quelle proteine che sono destinate all’esterno della cellula, all’interno delle membrane cellulari o all’interno delle cellule lisosomiali. Gli esperimenti sono stati fatti sul lievito, in quanto i processi che avvengono in questi organismi sono sovrapponibili a quelli umani, la sua via inizia dal reticolo endoplasmatico rugoso, si passa poi alla zona del Golgi prossimale, alla zona del Golgi intermedio e alla zona del Golgi distale, per poi passare alle vescicole che possono essere secrete o andare a dare origine alle strutture lisosomiali. In particolare queste proteine interagicono con la membrana del reticolo endoplasmatico nella stessa maniera con cui possiamo ritrovarle sulla membrana cellulare.

In questa particolare via di segnale interagiscono ribonucleoproteine SRP (Signal Recognition Particle), composte ciascuna da 6 polipeptidi e da una catena di RNA di 300 nucleotidi. Queste proteine all’interno del SRP funzionano a coppie, in particolare la porzione superiore si lega al peptide centrale permettendo l’aggancio attraverso un legame idrofobico, e queste sono le regioni P19 e P54, al centro abbiamo le regioni P68 e P72 che sono richieste per il trasporto verso la membrana del reticolo del complesso ribosoma-proteina mentre le regioni P9 e P14 bloccano la sintesi della proteina. Questa molecola si rapporta al peptide segnale, e si aggancia al recettore del SRP sulla membrana del reticolo che si lega a P68 e P72. Questo recettore formato da due catene α e due catene β è associato ad un canale proteico chiamato traslocone, inizialmente chiuso, che poi avvenuto l’aggancio e l’idrolisi di una molecola di GTP si apre e il peptide segnale inizia ad infilarsi dentro, si aggancia ad una zona chiamata TRAM. A questo punto il peptide segnale può rimanere nel canale e instaurare una relazione di tipo idrofobico, oppure può entrare nel foglietto esterno del reticolo e lasciar passare la restante parte della proteina nel lume del reticolo. In ogni caso il canale ha la capacità di ruotare e di inserire le porzioni idrofobiche e idrofiliche rispettivamente nel foglietto lipidico e nel lume del compartimento durante la formazione della proteina stessa, dunque è un processo fondamentale, mentre se la sequenza segnale si lega alla membrana la proteina sarà destinata ad entrare completamente nel lume. Alla fine della sintesi proteica il peptide segnale deve poi andare incontro al clivaggio proteolitico, effettuato nella membrana del reticolo da una proteasi, si forma così un nuovo N-terminale che potrà entrare nel lume del reticolo. Qui sono presenti degli ciaperon (ad esempio citiamo il Hsp 70), che mantengono la proteina per un po’ in forma lineare, in modo che possa subire diverse modificazioni come la formazione dei ponti disolfuro o la glicosilazione. Le subunità ribosomali intanto si staccano dal reticolo e si disassemblano, per poi tornare libere nel citosol.

A questo punto citiamo la presenza di proteine residenti, ovvero proteine proprie che a livello di un particolare distretto svolgono la loro funzione senza mai spostarsi o cambiare luogo. A livello del reticolo, dove ricordiamo esserci un valore di pH = 6, esistono questo tipo di proteine compartimentalizzate, che sono la PDI21 (Protein Disolfuro Isomerasi 21) e la BIP (Binding Protein), infatti possiedono una sequenza C-terminale detta KDEL (lisina, acido glutammico, acido aspartico e lisina) che permette alla vescicola (ricoperta di clatrina) originata dalla zona distale del Golgi di tornare indietro per portare la proteina residente nel reticolo nella sua giusta localizzazione.

Le proteine secretorie subiscono diverse modificazioni, ovvero la formazione di ponti disolfuro, l’oligomerizzazione, la glicosilazione, la fosforilazione in posizione 6 del mannosio e il clivaggio proteolitico (in un processo che è tipo il taglio del peptide segnale quando le proteine secretorie entrano nel reticolo).

La FORMAZIONE DI PONTI DISOLFURO dipende dalla concentrazione di glutatione ridotto e glutatione ossidato nel reticolo, infatti in base al pH la formazione dei ponti disolfuro è un processo molto più efficiente che nel citoplasma. Questa reazione è catalizzata dalla PDI21, mentre infatti gli ciaperons stabilizzano la catena in maniera lineare, la PDI21 procede per tentativi andando a formare legami disolfuro tra residui di cisteina, poi vede se la struttura secondaria può essere funzionale o meno, infatti si possono creare tratti idrofobici esposti esternamente che non permettono la solubilità della proteina, oppure se viene forzata l’angolazione del legame peptidico si creano delle forze di trazione che destabilizzano la proteina. Se la struttura rimane stabile dopo la formazione dei ponti disolfuro, allora quella è la struttura secondaria, oppure la PDI21 taglia il legame e ritenta, la BIP invece a questo livello può legare tratti idrofobici della proteina, segnalando alla PDI21 che la situazione non va bene, che la struttura secondaria della proteina non può essere mantenuta. Alla fine del processo comunque tutto ciò è drammaticamente stabile, anche perchè se tratto la proteina con β-mercaptoetanolo, rompendo tutti i ponti disolfuro ed elimino poi questo mercaptano, se faccio funzionare ora gli enzimi del reticolo vedo che la struttura secondaria della proteina che esce è sempre lo stessa, ed è sempre funzionale a ciò che deve svolgere, anche se il numero di errori della PDI può essere di numero variabile. Ad esempio nelle immunoglobuline ci sono tanti ponti disolfuro che tengono insieme la struttura, ma anche il collagene è formato da numerosi ponti disolfuro a livello delle sue tre catene che si relazionano, ed è una struttura importante che può essere prodotta nella catena della “cell factory”, ovvero da altri organismi organici, si parla così di proteina ricombinante, ma l’applicazione odierna in questo campo più diffusa è la produzione di farmaci ricombinanti. In particolari condizioni non ottimali nel processo di formazione dei ponti disolfuro possiamo avere una situazione da ingolfamento del reticolo endoplasmatico rugoso, nel senso che ci sono troppe proteine che stazionano e si depositano nel reticolo, ma la cellula riesce a sopperire a questa situazione grazie ad un meccanismo di autofagia, si parla infatti di eliminazione molto mirata di questa porzione del reticolo endoplasmatico rugoso, che poi permettono al reticolo di riformare la sua struttura caratteristica e le sue peculiari funzioni.

Esiste anche il processo di OLIGOMERIZZAZIONE, che può avvenire nel reticolo endoplasmatico rugoso e nell’apparato del Golgi prima che la proteina sia secreta, si parla in particolare di associazione di più monomeri, ad esempio le IgM secretorie (responsabili della risposta primaria all’antigene) sono pentameriche e vengono legate da una “join protein”, processo molto attivo nelle cellule linfocitarie, oppure nella formazione delle IgA dimeriche seguiamo questo processo, ma la oligomerizzazione può avvenire anche sulla membrana plasmatica, ad esempio la glicoforina è un trimero presente sui globuli rossi.

La GLICOSILAZIONE può essere una O-glicosilazione, ovvero pochi residui monosaccaridici (N-acetilglucosammina, galattosio e acido sialico) vengono attaccati su un residuo OH di una serina o di una treonina, e questo è un processo che compete in maniera importante con la fosforilazione, in questo modo però viene stabilizzata la proteina che può avere parecchie ore in più di funzionamento, mentre la N-glicosilazione, molto importante per la maturazione delle proteine secretorie, avviene su un residuo amminico di un’asparagina, ed è un po’ più complicato perchè ci sono parecchi monosaccaridi, circa 15, tra cui possono essere presenti diversi mannosi. I substrati che cedono gli zuccheri sono composti nucleotidici, infatti da nucleotidi difosfato ricaviamo l’energia catalica per far avvenire il processo. La prima reazione di formazione dell’oligosaccaride avviene sul versante citosolico della membrana, in particolare al dolicolo (un lipide di membrana) l’idrolisi di un UDP serve per legare ad esempio N-acetilglucosammina, poi vengono legati altri monosaccaridi ed interviene la flippasi che inverte tutta questa struttura e lo porta nel lume del reticolo endoplasmatico. Questo processo però è ancora incompleto, infatti nel reticolo deve esistere un trasportatore specifico, ad esempio per un UDP-galattosio che una volta entrato nel reticolo e staccato il galattosio, esce come nucleotide monofosfato e con il fosfato inorganico sempre attraverso lo stesso trasportatore. Alla fine una specifica oligosaccaride transferasi, quando l’oligosaccaride è stato formato, lo trasferisce su un residuo amminico di un’asparagina che si ritrova così N-glicosilata, poi la maturazione finale delle proteine secretorie avviene con la modificazione dell’oligosaccaride nell’apparato del Golgi.

La FOSFORILAZIONE DI UN MANNOSIO in posizione 6 è fondamentale per la veicolazione delle proteine nel compartimento lisosomiale, infatti queste proteine sono tutte proenzimi che nella forma attiva sono in grado di digerire ogni composto cellulare. In queste vescicole appartenenti all’apparato del Golgi e rivestite da clatrina abbiamo in particolare recettori per il mannosio-6-fosfato, a cui si legano questi proenzimi. Questi proenzimi possono venire attivati con una modificazione del livello di pH grazie alla fusione della vescicola lisosomiale con un endosoma tardivo, questo infatti serve ad attivare i proenzimi e a staccarli dai recettori del mannosio-6-fosfato, viene dunque permessa la digestione del materiale cellulare da parte degli enzimi attivati del lisosoma. Queste proteine però possono essere rilasciate per sbaglio anche a livello cellulare, per esocitosi, ma c’è un meccanismo di recupero perchè i recettori del mannosio-6-fosfato sono presenti anche sulla superficie interna della membrana cellulare, vengono così evitati grossi problemi a livello cellulare.

L’ultima modificazione è il CLIVAGGIO PROTEOLITICO, ad esempio l’albumina è una proteina secretoria che viene attivata da un clivaggio di due arginine iniziali, il tutto mentre viene secreta, oppure per quanto riguarda la pre-pro-insulina e la pro-insulina vediamo che viene tolto il peptide segnale e il peptide C, con la conseguente formazione di ponti disolfuro che tengono unite le strutture A e B che vanno a formare l’insulina in forma attiva, ma anche numerosi altri ormoni (come il glucagone) vanno incontro a questi processi. È importante che questi clivaggi proteolitici non si attivino durante il percorso di sintesi di queste proteine, perchè possono partire vie di trasduzione del segnale che non sono soggette a nessun controllo.