Recettori tirosin chinasici

Andiamo ora a descrivere la via mitogenica classica o chiamata anche VIA DELLE MAP CHINASI: analizziamo nello specifico la via di trasduzione del segnale tramite questi recettori, che come abbiamo visto porta alla proliferazione cellulare ed è detta per questo via mitogenica. Prendiamo ad esempio il PDGF (ma è solo un esempio, in quanto non è l’unico dei fattori citati che agisce così), che agisce in forma di omodimero su due recettori (solitamente su una zona ben concentrata della cellula dove sono presenti questi recettori), infatti anche il recettore dimerizza, e questo fatto è generalizzabile, in quanto la maggior parte dei recettori tirosin-chinasici agisce così, anche se abbiamo dei casi nei quali il recettore si trova in forma monomerica o in associazione con altre proteine. Questo fatto è significativo perché nel recettore omodimerizzato avviene che le porzioni intracitoplasmatiche si trovano ad avere diverse tirosine vicine che si transfosforilano (in questo caso sul PDGF si parla di 5 tirosine fosforilate), mentre nel caso in cui il recettore sia sottoforma di monomero, avverrà invece una autofosforilazione. Esistono farmaci che competono con queste vie di trasduzione del segnale, andando a legarsi a livello del sito di legame per l’ATP con una molecola avente la stessa stechiometria dell’ATP e non tossica, che non permette appunto l’idrolisi dell’ATP, bloccando dunque di fatto l’intera via segnalatoria. Fatto sta che comunque le tirosine si trovano fosforilate, e ciò fa sì che in corrispondenza di esse si leghino diverse proteine interattrici alla porzione intracitoplasmatica del recettore, con una specificità molto alta. Dobbiamo però chiederci come facciano queste tirosine a trans-fosforilarsi o ad auto-fosforilarsi, cioè quale sia il meccanismo biochimico che permette la fosforilazione nella sede intracitoplasmatica di questi recettori con attività catalitica. Abbiamo che tutti i recettori tirosin-chinasici hanno un “ATP-binding site” nella regione intracitoplasmatica, cioè a monte del dominio chinasico c’è un dominio nel quale, a seguito dell’interazione con il ligando, si lega ATP: ciò accade perché l’arrivo del fattore di crescita modifica la conformazione del recettore, e questo espone il sito di legame per l’ATP. Questa molecola di ATP, dopo essere stata legata dal sito attivo, si scinde in ADP + Pi ed il gruppo fosfato viene ceduto al dominio chinasico, che viene così attivato e fosforila un residuo di tirosina sulla catena aminoacidica del recettore adiacente o sullo stesso recettore. Infatti se siamo di fronte ad una transfosforilazione, come nel caso del recettore per PDGF, il dominio chinasico di una catena fosforila una tirosina sull’altra subunità, mentre se il recettore è in forma monomerica avviene l’autofosforilazione, cioè l’attività chinasica viene esercitata su una tirosina della catena stessa. Il risultato è comunque una serie di tirosine fosforilate nella porzione intracellulare del recettore. A questo punto dobbiamo però specificare anche i meccanismi che portano alla specificità del legame con le varie proteine adattatrici, dette adattatori primari. In particolare abbiamo che tutte queste proteine devono avere un dominio detto SH2 che determina l’interazione specifica con il complesso ligando-recettore. Abbiamo che sul recettore, a partire dalla tirosina fosforilata (che possono essere anche più di una), c’è una sequenza di consenso, cioè dopo la tirosina abbiamo diversi amminoacidi in determinate posizioni che formano una sequenza precisa che viene riconosciuta da un dominio SH2 di una proteina. Questo dominio si chiama SH2 perchè la SRC è stata la prima tirosin cinasi ad essere isolata (la sigla SH indica infatti SRC Homology), e da qui sono stati individuati dei domini funzionali come SH2, SH1, SH3 o PTB (dominio funzionale che permette l’aggancio alla membrana plasmatica), che nelle proteine che andiamo ad analizzare sono proprio chiamati così perchè sono domini analoghi a quelli che sono presenti nella SRC, anche se differiscono comunque per un 20 % per il loro diverso sviluppo evolutivo. In questo modo le proteine, tramite i loro domini SH2 (che sono omologhi all’80 %), riescono a legare specifiche sequenze consenso sul recettore di competenza che vengono “segnalate” dalla tirosina fosforilata. Infatti possiamo affermare che solo se la tirosina è fosforilata l’SH2 “trova” la sequenza consenso, e la tirosina è fosforilata solo se è avvenuta l’interazione del recettore con il suo ligando, quindi in definitiva le proteine adattatrici possono entrare in gioco solo dopo che il fattore di crescita ha interagito con la cellula. Semplificando, possiamo fare un’analogia con il meccanismo di chiusura dei bottoni a pressione: se la sporgenza da un lato non va a corrispondere perfettamente all’incavo dall’altra parte, non si ha una chiusura perfetta, ma ci vuole una corrispondenza specifica. L’esistenza delle proteine modulari è dovuta al fatto che durante l’evoluzione le regioni geniche codificanti per un determinato modulo (SH1, SH2, SH3 o PTB) si sono endoduplicate, sono stati inseriti in diverse sequenze geniche, in cui si è notata una certa divergenza per occasionali mutazioni avvenute a questi domini, creando delle regioni di DNA ad alta omologia. Quando poi i geni vengono tradotti, le proteine che ne risultano presentano più copie di certi domini funzionali, proprio perchè nel DNA c’erano sequenze che si ripetevano su geni che codificavano per proteine diverse, infatti una proteina può trovarsi ad avere più domini funzionali diversi perchè le varie sequenze geniche risultano tradotte e incastrate in modo differente. Continuando la descrizione della via mitogenica classica, vediamo che su questa cascata segnalatoria abbiamo la proteina adattatrice GRB2 (o la SHC, che comunque è molto simile) che ha un dominio SH2 e due domini SH3, e sappiamo già che è SH2 ad interagire con la sequenza consenso sul recettore, quindi ne risulta che sarà SH3 ad interagire con la proteina che segue nella cascata segnalatoria, perché è il solo dominio che rimane esposto. Quindi si ha questa interazione tra GRB2 e il recettore, che nel nostro caso era quello per il PDGF, al di sotto della membrana plasmatica, e rimane esposto SH3, dominio che riconosce le “Prolin Rich Region”, cioè dei domini strutturali che portano 4 proline distribuite spazialmente in un certo modo. Quindi l’impilamento di proteine diverse prosegue con una proteina che ha queste regioni ricche in prolina e in particolare si tratta di SOS, elemento molto importante che è una “GTP-GDP Exchange Protein”, cioè è in grado di scambiare una molecola di GTP con una molecola di GDP. Quindi, secondo questa sua definizione, SOS andrà a caricare una proteina G, e in particolare sarà la proteina G monomerica di membrana P21-RAS ad essere coinvolta. Ricordiamo che P21-RAS è inserita nella membrana plasmatica grazie ad una modificazione post-traduzionale che ha subito nel corso della sua maturazione, che è la farnesilazione, che mi permette di tenerla aggianciata al foglietto lipidico. RAS è in grado di attivare delle serin-treonin chinasi dette MAP (Mytogen Activating Protein) chinasi mediante un meccanismo che prevede l’idrolisi del GTP, in modo da fornire alla chinasi il gruppo fosfato per la sua attività fosforilativa. Così facendo, inoltre, RAS si inattiva, perché lega GDP e non GTP, e quindi non continua la trasmissione del segnale ad oltranza. A questo punto abbiamo la cascata delle chinasi citosoliche: MAPKKK attiva MAPKK che a sua volta attiva MAPK (queste attivazioni sono date da successive fosforilazioni), che è in grado di entrare nel nucleo grazie ad una traslocazione specifica. Una volta nel nucleo, MAPK va a fosforilare il fattore trascrizionale c-JUN che è così in grado di formare un eterodimero con un altro fattore, c-FOS. Questo complesso è detto AP1, e va a posizionarsi su geni che hanno la specifica sequenza consenso, promuovendo un programma genetico di proliferazione. È chiaro che i geni che rispondono all’attività di “c-FOS” e “c-JUN” sono protoncogeni, in quanto se alterati possono portare a proliferazione tumorale, cioè sono attivati costituitvamente.

È molto importante per un medico conoscere questa via, poiché ci sono molti farmaci che la bloccano, soprattutto nelle terapie antitumorali, ad esempio abbiamo gli inibitori delle farnesil-transferasi, farmaci sperimentali che impediscono la farnesilazione e quindi bloccano P21RAS nel citoplasma impedendogli di attaccarsi alla membrana, e invalidando tutta la via proliferativa, poiché manca il target specifico che permette il mantenimento del segnale. Questo è particolarmente utile nei tumori dove RAS è mutato, dove è costitutivamente espresso ed esercita la sua azione senza bisogno dello stimolo di SOS, così che la cellula prolifera senza controllo. Ma si può agire anche più a monte in questa via, con un farmaco che compete con l’ATP per l’occupazione del sito sui recettori tirosin-chinasici, impedendo alla fosforilazione di partire.

Dobbiamo osservare che al recettore tirosin-chinasico si possono legare anche altre proteine, ad esempio la sequenza consenso sul recettore fosforilato in tirosina può legare PLC-γ che, essendo una fosfolipasi, fa partire la via dell’inositolo-3-fosfato analogamente alla fosfolipasi C-β, con la sola differenza che quest’ultima è una proteina di membrana, mentre la PLC-γ agisce legata al recettore. Sappiamo già che la fosfolipasi scinde il PIP3 in IP3 e diacilglicerolo. L’IP3, piccola molecola idrosolubile, lascia la membrana plasmatica e rapidamente diffonde attraverso il citoplasma, per poi legarsi a specifici canali di rilascio del calcio sulla membrana del reticolo endoplasmatico, con il calcio rilasciato che si lega agli stessi canali promuovendo il rilascio di altro calcio per feed-back positivo, si verifica così un aumento transiente del calcio intracitoplasmatico, che poi viene tacitato dall’inattivazione di IP3 e dal ripompaggio del calcio all’interno del reticolo e fuori dalla cellula. Invece il DAG attiva una serin-treonin chinasi, la PKC, che va a fosforilare specifiche proteine target, causando un meccanismo di fosforilazione a cascata (ma il DAG può anche essere idrolizzato ad acido arachidonico, che è il precursore delle prostaglandine e che può fungere esso stesso da secondo messaggero). Quindi abbiamo che il calcio intracitoplasmatico si lega alla calmodulina, che come la PKC è in grado di attivare meccanismi che vanno a fosforilare le MAP chinasi o altre proteine che rientrano nella via mitogenica. Alla fine vediamo che attraverso diverse vie segnalatorie possiamo avere un rafforzamento della via mitogenica, perchè alla fine esse convergono sulla via di proliferazione cellulare. Partendo da più punti, si attiva la proliferazione cellulare in maniera molto impressionante. Se è attiva la proliferazione cellulare, non è attivo il processo di differenziamento cellulare o apoptosi, se invece la proliferazione non viene attivata, la cellula va incontro ad altre vie funzionali, come quelle citate in precedenza.

Inoltre ci sono moltissime altre chinasi in grado di coadiuvare l’attivazione di questa via proliferativa interagendo ad un livello specifico ben definito, ed avere un quadro completo ed ordinato è alquanto difficile, in quanto si formano, sotto la membrana, filiere di proteine che possono interagire in vario modo secondo i loro diversi domini funzionali. Quindi ci accontentiamo di aver definito le modalità di interazione biochimica della via di GRB2-SOS-RAS, che dobbiamo conoscere molto bene. Infatti in campo medico la conoscenza di questa via è essenziale per le “target therapy”, le terapie specifiche per un certo enzima che permettono ad un trattamento di essere meno invasivo. Per definire una “target therapy” per un certo tumore, si deve conoscere la via proliferativa che quel tumore utilizza per poterla compromettere e cercare di guarire il paziente. Ciò si può fare iniettando anticorpi specifici che indicano se una certa proteina è attiva, ad esempio esiste un anticorpo che lega MAPK fosforilato.