Recettori degli ormoni steroidei

Per quanto riguarda la via di trasduzione del segnale degli ORMONI STEROIDEI, vediamo come sostanze lipofile che possono essere il cortisolo, l’estradiolo, il testosterone o le vitamine A e D circolano associate a un carrier che le trasporta in un ambiente idrofilico perché altrimenti non starebbero in soluzione, poi passano liberamente la membrana cellulare e vengono subito legate da una famiglia di recettori nucleari appartenenti alla famiglia degli ormoni steroidei. Questa è una famiglia perché tutti i recettori sono caratterizzati da un dominio in comune, il dominio di legame al DNA. Quindi il DNA Binding Domain, che diverge un po’ da recettore a recettore, è quello che caratterizza questa famiglia più di tutto il resto della proteina, infatti le due estremità proteiche del recettore possono avere funzioni diverse.

Nella famiglia di recettori degli ormoni steroidei si identificano come minimo un certo numero di domini che sono presenti in tutti i recettori, in particolare i domini importanti sono 4: abbiamo un dominio di legame al DNA, quello che caratterizza di più il recettore, è una sequenza di 68 amminoacidi (DNA Binding Domain), inoltre hanno un dominio di legame al ligando (Ligand Binding Domain), inoltre hanno un dominio di attivazione in quanto comportandosi da fattori trascrizionali non è sufficiente che si leghino al DNA ma devono anche attivare la trascrizione, inoltre hanno un dominio di interazione proteina-proteina, perchè possono formare eterodimeri con altre proteine.

Questi recettori sono dei fattori trascrizionali che si legano a sequenze consenso sui promotori dei geni e i geni che hanno nei promotori queste sequenze consenso si chiamano elementi di risposta primaria perché è direttamente il recettore legato all’ormone o alla vitamina che attiva la loro trascrizione. Se osserviamo ad esempio l’elemento di riconoscimento sul promotore di un gene dell’acido retinoico (Retinoid Acid Receptor Element), un RARE è una sequenza che risponde a queste caratteristiche, ovvero formata da 6 nucleotidi (AGGTCA), da una spaziatura di 5 nucleotidi che non centrano niente e dalla ripresa del motivo che costituisce questa sequenza. Questo è quello che permette al recettore dell’acido retinoico di legarsi al DNA. Ci sono tre tipi di RARE, ovvero α (il più importante), β e γ. Se però prendiamo la vitamina D, la differenza fondamentale di questo VDRE come sequenza di consenso sta nella spaziatura, che questa volta è di 3 nucleotidi, dunque la differenza è sottile: è la spaziatura dei due elementi di riconoscimento che cambia, e non le sequenze segnale, ad esempio se prendiamo la sequenza per il cortisolo, vediamo che la spaziatura è di 1. Quindi gli elementi di risposta primaria con la spaziatura più grande hanno bisogno di una maggiore superficie di appoggio, mentre quelli che hanno una spaziatura stretta hanno minor bisogno di appoggio, la conseguenza è che cambia il posizionamento del recettore sul DNA. La differenza di specificità non è quindi in questo caso così stringente perché tra vitamina A e D ci si potrebbe anche sbagliare nel far partire una via di trasduzione del segnale, ci sono infatti dei casi di ambiguità di risposta. La regione promotrice che ha queste sequenze consenso che chiamiamo Ormon Responsive Element (HRE) sono geni di risposta primaria, infatti sono attivati subito nella loro trascrizione da questo tipo di evento.

Facciamo l’esempio della VITAMINA D: essa viene portata da un trasportatore, passa la membrana cellulare e all’interno trova il VDR (Vitamin D Receptor). La vitamina D per rimanere in soluzione la prima cosa che fa è quella di legarsi a un carrier che la tiene nel citosol o al recettore nella regione del Ligand Binding Domain. Si forma un complesso ligando-recettore nel citoplasma e il legame con il Ligand Binding Domain è sufficiente per mantenere la proteina in soluzione, poi interagisce con un altro recettore e si forma un etero-dimero (entra il gioco il dominio di interazione con altre proteine). Questo recettore è siglato RXR (X perché non si conosceva il ligando con cui si legava il recettore, adesso si sa che è una isoforma dell’acido retinoico, il 9-cis). Quindi questo recettore RXR è attivato quando l’acido 9-cis retinoico si lega a questo livello. Quello che succede subito dopo è che si forma un eterodimero tra VDR, la vitamina D, l’RXR e l’acido 9-cis-retinoico. Si forma dunque questo grosso complesso che va al nucleo. C’è però un ulteriore step di modificazione, infatti per ottenere questa eterodimerizzazione, il recettore della vitamina D è fosforilato da una chinasi di membrana, citoplasmatica, che si chiama Protein Kinase C (PKC), infatti solo dopo che è fosforilato eterodimerizza. A questo punto questo complesso si trova nel nucleo e si va a posizionare sul promotore riconoscendo le sequenze consenso che abbiamo visto prima. La situazione è però più complessa, infatti ora sul promotore questi eterodimeri vanno incontro al fenomeno di impilamento di proteine coattivatori, che favoriscono l’attivazione di questo eterodimero, ma in altri casi, quando sono presenti altri ormoni steroidei, questi eterodimeri (o anche monomeri se funzionano in questa maniera) possono legare costitutivamente dei corepressori, che determinano la repressione della funzione di questo eterodimero, poi l’interazione con il ligando porterà ad una loro modificazione conformazionale che determinerà il loro reclutamento di coattivatori per favorire stavolta la trascrizione genica.

Il concetto di gene di risposta primaria è importante per il programma genetico, ad esempio l’acido retinoico (o vitamina A) fa differenziare molte cellule, attiva un programma differenziativo, infatti abbiamo l’espressione dei geni di risposta primaria, tra cui ci sono anche dei fattori trascrizionali che trascritti diventano la risposta secondaria, si attiva così un’altra ondata di trascrizione. Nella risposta secondaria ci sono poi altri fattori trascrizionali e si può attivare una cascata di risposta terziaria e così via fino al completamento del programma genetico. Si può partire da 100-150 geni ma alla fine tra le tre risposte cellulari sono migliaia i geni che vengono trascritti e che permettono alla cellula di completare la differenziazione. Tutti i programmi genetici fanno così, ovvero da diverse risposte mantenute una dopo l’altra, si ha il completamento del programma genetico, questo vuol dire un importante espressione genica che porta al funzionamento di numerose proteine.

Ora se andiamo a studiare in particolare una classe molecole degli ormoni steroidei, vediamo come è importante sottolineare come ci siano tre isoforme di acido retinoico, in particolare la più usata in terapia nelle leucemie promielocitiche acute è lo ”All Trans Retinoic Acid” (ATRA), invece il 3,4-Diretinoic Acid non ha una funzione particolare, o perlomeno non come fattore di trascrizione, in quanto non lega RXR, mentre l’acido 9-cis-retinoico lega RXR ma non fa differenziare la cellula.

L’unica isoforma che fa differenziare la cellula e lo ”All Trans Retinoic Acid”. L’acido retinoico comunque non è solo un elemento differenziante ma è anche un agente morfogenetico, infatti lo sviluppo craniocaudale dell’organismo dipende dal gradiente dell’acido retinoico e quindi anche di queste isoforme diverse dell’acido retinoico.

Le strutture di questi recettori sono sempre uguali, hanno lo stesso schema, in particolare hanno gli stessi domini funzionali del recettore della vitamina D, anche qua c’è il “DNA Binding Domain” ed il “Ligand Binding Domain”, il dominio di interazione con altre proteine e il dominio di trans-attivazione, inoltre ci sono anche domini di fosforilazione da parte di serin-treonin cinasi. Le proteine che possono legare nel citoplasma l’acido retinoico tenendolo sequestrato sono le crap proteins, invece quando si unisce al recettore RAR-α va nel nucleo e lavora sui geni di risposta primaria con le sequenze consenso che abbiamo visto prima. Quindi riassumendo l’acido retinoico entra nella cellula e trova il suo recettore-α, trova RXR legato a acido 9-cis-retinoico, si forma un grosso complesso che anche in questo caso va a posizionarsi su regioni promotrici sul DNA nucleare e c’è una serie di geni che sono indotti come risposta primaria dall’acido retinoico.

Le SEQUENZE CONSENSO che abbiamo visto sono quelle canoniche però la faccenda è molto più complicata, infatti queste sequenze possono andare in degenerazione. Esse non sono tutte uguali, hanno infatti delle varianti nucleotidiche, per cui stabilire qual è la matrice che risponde all’acido retinoico è difficile, più la si studia e più ci sono delle varianti nucleotidiche sulla sequenza consenso canonica. Per questo, basandosi sul fatto che sulla sequenza “esanucleotide-spaziatura-esanucleotide” ci possono essere delle varianti nucleotidiche, non posso fare una predizione dei geni di risposta primaria, devo per forza andarli a studiare uno per uno. Ci sono però delle formule che consentono di calcolare quanti varianti nucleotidiche delle sequenze consenso ci sono, ma allo stato odierno neanche le migliori applicazioni della bioinformatica sulla degenerazione della matrice mi riescono a dire quanti sono i geni di risposta primaria di un determinato recettore nucleare.

Se analizziamo le condizioni patologiche, vediamo che nelle leucemie acute, questo complesso etero-dimerico lega dei coinibitori, ed il classico è l’istone deacetilasi, infatti a questo livello la trascrizione viene bloccata in quanto la deacetilazione (l’acetilazione degli istoni invece permette la trascrizione) condensa la cromatina e blocca la trascrizione. Questo è esattamente quello che succede nella leucemia promielocitica acuta dove inizialmente il recettore per l’acido retinoico non funziona, bisogna andare ad innalzare le dosi farmacologiche per farlo funzionare, dare una quantità notevole di acido retinoico.