Proteine di membrana

La membrana cellulare è costituita da un doppio strato fosfolipidico in cui sono immerse numerose proteine, in cui la composizione è molto variabile, in particolare si può parlare della membrana cellulare degli eritrociti che contiene il 49 % di proteine ed un 40 % di fosfolipidi, mentre la mielina degli assoni è fondamentalmente costituita da fosfolipidi. In particolare si parla di proteine integrali di membrana, formate da amminoacidi idrofobici che stanno all’interno della membrana cellulare, e che vengono prodotte attraverso la cosiddetta fase secretoria. In base a ciò quello che è presente sull’esterno della cellula le permette di svolgere particolari funzioni, in particolare queste proteine possono avere diversa struttura e le proteine possono interagire tra loro attraverso diversi legami all’esterno della struttura lipidica, dunque si parla anche di proteine periferiche. A queste proteine possono essere legati anche glucidi, si parla in particolare di glicolipidi e glicoproteine, che svolgono ruoli importantissimi, ad esempio i gruppi sanguigni sono dati da glicolipidi. Per topologia delle proteine di membrana intendiamo le diverse conformazioni di proteine a livello della membrana cellulare, in particolare queste proteine possono avere diversi tratti transmembrana ad α-elica che le stabilizzano internamente alla membrana, possiamo avere un canale trasportatore delimitato da più proteine, avente una dinamica aperta o chiusa che regola finemente il passaggio di molte sostanze, altre proteine possono invece interagire con un solo foglietto della membrana cellulare, ad esempio la P21-RAS (proteina G monomerica) o la P60-SRC (enzima tirosin-cinasico) per una modificazione sono agganciate ad un acido grasso, attraverso rispettivamente dei processi di farnesilazione e di miristilazione, e questo acido grasso va ad inserirsi nella membrana cellulare: questa configurazione permette a queste proteine di andare a svolgere le loro funzioni in maniera corretta. Per lo stesso meccanismo possono esserci invece proteine rivolte verso l’esterno della cellula, tipo quelle presenti nel glicocalice, in particolare dove si possono agganciare enzimi.

È molto importante anche la FLUIDITÁ delle membrane cellulari, che in particolare dipende dalla composizione della membrana cellulare, infatti un’elevata presenza di colesterolo la rende piuttosto rigida, è importante poi vedere come ad alte temperaure, più di 40 °C, la membrana diventa semifluida e può andare incontro a citolisi con conseguente distruzione delle membrane cellulari, come nella mononucleosi infettiva, che porta alla modificazione delle cellule germinali e delle cellule sensoriali dell’orecchio, le prime che vengono lisate da un meccanismo di questo tipo.

In realtà esiste anche un ricambio continuo di fosfolipidi, dato dalle fosfolipasi che digeriscono i fosfolipidi, ma in generale possiamo vedere come ci sia un ricambio da una membrana all’altra che modifica continuamente la struttura di una membrana cellulare, sia nel tempo ma sia anche dal foglietto esterno al foglietto interno. In particolare la flippasi è un enzima che sposta continuamente i fosfolipidi dal foglietto interno al foglietto esterno della cellula, in questa maniera la mobilità delle proteine è elevatissima, possono così andare a svolgere le loro funzioni o essere digerite da proteasi con cui vengono a contatto.

Consideriamo la membrana cellulare, sia quella esterna, sia quella che compone gli organelli interni della cellula: il foglietto che guarda il citosol è sempre considerato quello interno, mentre quello che guarda l’ambiente extracellulare o il lume di un organello è considerato il foglietto esterno. Il lume quindi è considerato ambiente extracellulare. Questo è importante anche per il discorso riguardante il trasporto delle proteine di membrana dal reticolo endoplasmatico rugoso alla membrana: sia nel reticolo che nelle vescicole di trasporto, e poi sulla membrana la polarità della proteina è mantenuta (abbiamo un tratto citosolico, un tratto transmembrana e un tratto extracellulare).

I LIPOSOMI, strutture a doppio strato fosfolipidico e circolari, sono strutture molto importanti da studiare in campo terapeutico perchè possono contenere farmaci che devono essere però specifici per le cellule bersaglio, e questo può processo può essere mediato ad esempio con particolari proteine o ligandi che ci permettono di dirigerci verso particolari tessuti, ad esempio questa tecnica è molto importante in laboratorio. In particolare se devo studiare la funzione di una proteina di membrana, posso isolarla in modo da avere un liposoma attraverso cui posso vedere come agisce a livello dell’organismo.

Ma come studio le proteine integrali di membrana? I globuli rossi hanno la particolarità di derivare da eritroblasti che non vanno in apoptosi ma fanno solo un processo di estrusione del nucleo, al suo interno è praticamente presente solo emoglobina (anche se non è ancora stato risolto il problema del perchè non precipiti questa proteina nei globuli rossi, date le sue elevate concentrazioni), operiamo così una lisi osmotica mettendo il globulo rosso in soluzione ipotonica, ovvero una soluzione con concentrazione inferiore a 0,15 M di NaCl, così il globulo rosso si gonfia e si supera la resistenza della membrana. Possiamo utilizzare queste tecniche anche nell’eseguire il test di Simmel, ovvero osservo quando il globulo rosso patologico si lisa in una soluzione ipotonica rispetto allo stesso processo che avviene però in un globulo rosso normale, per cercare di identificare la patologia stessa. Possiamo studiare le proteine con tecniche odierne attraverso l’elettroforesi su gel monodimensionale (identificata con SDSPAGE), che mi consente di separarle secondo il peso molecolare: si prende ad esempio un globulo rosso e si isolano tutte le sue proteine di membrana, poi si procede a pretrattarle con SDS (sodiododecilsolfato 9), che conferisce alle proteine una carica omogenea negativa, questo per far sì che le proteine, successivamente immesse in un campo elettrico, all’interno del gel di poliacrilammide migreranno secondo il loro peso molecolare verso il polo positivo del macchinario. Ora attraverso la tecnica dell’IMMUNOGLOTTING (o Western Blot) posso trasferire queste proteine su una membrana di nylon dove posso attraverso un anticorpo con tracciante fluorescente o radioattivo, vedere se è presente quella determinata proteina che stavo cercando, ma se ci sono delle bande di proteine molto spesse, indice della presenza di diverse proteine con uno stesso peso molecolare, vado a separarle secondo un altra dimensione, ovvero utilizzo un gradiente di pH, e le separo dunque anche secondo il loro punto isoelettrico (valore di pH in cui la proteina si presenta elettricamente neutra). Questa si chiama tecnica dell’ISOELETTROFOCUSING, che mi permette di ottenere proteine divise in 500-600 (a volte fino a 1000) spots, ovvero puntini che corrispondono ognuno ad una proteina. Dopodichè si prelevano questi spots, attraverso dei bracci robotici, si opera su di loro la digestione triptica, e li si inserisce nello spettrometro di massa, che identifica la proteina trovando la sua struttura e confrontandola in un vasto database. Questa tecnica è la base della moderna proteomica ed è chiaramente strutturata nei passaggi che abbiamo analizzato ora.

Vediamo ora una proteina transmembrana particolare chiamata glicoforina che è identificabile praticamente solo con la tecnica di “Western Blot”: questa proteina ha un tratto transmembrana dove è presente una bolla, ovvero un accorpamento di amminoacidi idrofilici, le cui cariche si annullano a vicenda consentendo loro di rimanere in ambiente idrofobo. Le bolle sono pericolose perché possono cambiare la permeabilità della membrana. In particolare si ricollegano al discorso del problema mutazionale: se la proteina venisse tradotta con un amminoacido carico negativamente nel tratto transmembrana, al posto di uno carico positivamente, a causa di una mutazione del gene, si avrebbero ripercussioni gravi sulla sopravvivenza della proteina nella cellula, vista l’importanza della permeabilità della membrana. In figura possiamo inoltre notare le interazioni ioniche, che sia all’inizio del tratto citosolico, sia all’inizio di quello extracellulare, gli amminoacidi della proteina instaurano con le teste idrofiliche dei fosfolipidi di membrana: queste interazioni agganciano la proteina alla membrana in maniera molto forte.

Nell’elettroforesi su gel, l’intensità della banda, legata come abbiamo visto ad una proteina che otteniamo, è direttamente proporzionale alla quantità di quel tipo di proteina. Come possiamo notare su un globulo rosso, una banda fra quelle ottenute corrisponde ai microfilamenti di actina. Questo ci dice una cosa importante: se abbiamo ottenuto la banda dell’actina significa che questa proteina è rimasta legata alla membrana quando si è trattato di isolarne le proteine, si può facilmente dedurre che esistono delle interazioni tra proteine che legano l’actina ad altre proteine, che a loro volta attraverso altri legami, sono legate alle proteine di membrana. Le proteine hanno dunque dei domini funzionali d’interazione, che permettono loro di prendere rapporti tra di esse nel modo più vario. Studiamo ad esempio la banda 3, ovvero la proteina corrispondente alla banda 3 nell’elettroforesi su gel monodimensionale: topologicamente è una proteina α-elica di membrana multipass, con 14 tratti transmembrana. È una proteina presente in tutte le cellule e fondamentale per la vita, visto che nei topi da laboratorio “knock-out”, ovvero in quei topi in cui il gene per questa proteina è stato silenziato, si assisteva sempre ad aborti. Vediamo che nell’N-terminale (rivolto verso il citosol) la proteina ha dei siti di legame per alcuni enzimi glicolitici e l’emoglobina, mentre all’estremità C-terminale va a legare l’anchirina e la banda 4.1. Altre proteine in grado di legare altre proteine e fungere quindi da mediatori d’attacco sono l’anchirina e la spettrina. Come vediamo si forma sotto alla membrana del globulo rosso un vero e proprio reticolo di proteine.

Ora cominciamo a studiare quali sono le funzioni della banda 3, o meglio della proteina della banda 3 degli eritrociti, ma in generale di tutte le cellule, visto che come abbiamo visto questa proteina è molto importante per la sopravvivenza cellulare.

La prima fondamentale funzione della banda 3 è quella che compie nella forma monomerica, ossia quella di ancoraggio dei microfilamenti di actina sulla membrana cellulare. Infatti la banda 3 è in grado di legare l’anchirina, che a sua volta lega la spettrina, che a sua volta lega la banda 4.1 e l’adducina, che infine legano i microfilamenti di actina. Si forma dunque una filiera di proteine, la cui esistenza dimostra il fatto che i microfilamenti di actina sono responsabili della morfologia del globulo rosso, della sua struttura a disco biconcavo. Essa è fondamentale perché se prendiamo ad esempio alcune patologie come la sferocitosi o l’ellissocitosi, che colpiscono gli eritrociti, ci rendiamo conto che quando questi globuli rossi a forma sferica o ellittica passano attraverso i vasi stretti, si rompono, causando emolisi intravasale e di conseguenza emoglobinemia (elevata concentrazione di emoglobina nel sangue), emoglobinuria e anemia. Queste malattie sono malattie genetiche che colpiscono alcune proteine della filiera che sta sotto la membrana, che risultano strutturalmente alterate, e in particolare l’anchirina e la spettrina. In questo modo cambia la morfologia del globulo rosso e ne risulta compromessa la funzione. Per diagnosticare queste malattie bisogna fare test genetici, dove posso valutare l’alterazione a livello di questi particolari cellule, prendo infatti cellule di sangue periferico e utilizzo la PCR per amplificare il mio tratto di DNA, ora posso così andare a ricostruire la sua sequenza nucleotidica, e se ci sono alterazioni si parla di patologia di sferocitosi: il difetto naturalmente salta fuori nei globuli rossi dove è importante questo tipo di proteina, ma non nelle altre cellule.

La seconda funzione, ancora più importante della prima, e quella che svolge la banda 3 nella sua forma omodimerica. In questa forma la proteina della banda 3 funziona come antiporto anionico, ovvero effettua uno scambio di ioni a carica negativa, in particolare lo ione bicarbonato HCO3ˉ e il cloroione Clˉ. Questo antiporto è presente in tutte le cellule, ma in particolare svolge una funzione importantissima nel globulo rosso, oltre che rientrare nei sistemi tampone del sangue. Importante è che ragioniamo sui processi in atto nel globulo rosso, quando si trova a livello dei capillari polmonari o quando si trova a livello di quelli tissutali, per non sbagliarci quando descriviamo l’azione dell’antiporto: infatti a livello dei capillari polmonari nei globuli rossi entra HCO3ˉ ed esce Clˉ, mentre a livello dei tessuti accade il contrario.