Proliferazione cellulare

La proliferazione cellulare è un concetto molto importante sia per la cellula staminale ematopoietica sia per ogni altro tessuto del nostro corpo come l’epidermide, ma anche in altri particolari locazioni che sono le cripte intestinali: a questo livello si trovano cellule staminali quiescenti nel fondo della cripta che possono proliferare e si differenziano nel loro tragitto in salita verso il lume intestinale, poi queste cellule differenziate, esaurito il tempo per svolgere le loro funzioni andranno incontro al fenomeno di apoptosi o morte cellulare. Questi sono concetti molto importanti, infatti questi fenomeni creano una situazione di equilibrio che permette il turnover intestinale con un ciclo di 25-28 giorni, in cui si origina un pool di cellule che assicura il ricambio del tessuto in un processo continuo. In particolare questo equilibrio deve essere mantenuto in tutti i tessuti in cui è presente, altrimenti si forma sempre una patologia, ad esempio si parla di situazioni di aplasia quando si arriva alla mancanza di tessuto, derivata da una ridotta proliferazione cellulare che prende il nome d’ipolasia, abbiamo invece delle situazioni d’iperplasia se c’è una proliferazione esagerata del tessuto, che se accompagnata da ridotte o cospicue alterazioni genetiche prende rispettivamente il nome di displasia o di neoplasia. I problemi insorgono se ad esempio in particolari trattamenti chemioterapici quindicinali determiniamo una distruzione dell’epitelio intestinale che non riesce così a rigenenerarsi, si originano così diversi disturbi intestinali, il sanguinamento dell’intestino e diverse altre complicanze, soprattutto per le chemioterapie indirizzate a tumori del colon-retto, un tumore molto poco trattabile, infatti la sopravvenza a 3 anni dei pazienti malati di questo tumore è intorno al 5 %.

Innanzitutto, tutto lo studio sulla proliferazione cellulare è stato permesso dal fatto che posso prendere delle cellule e posso metterle in coltura, dato che è molto difficile studiarle in vivo. Devo ovviamente dare loro tutti i mezzi per poter vivere e per poter duplicarsi, infatti le vado a diluire nel terreno di coltura ad una certa densità, in una capsula di vetro in cui vado a porre del siero di vitello fetale (in caso di una sua bassissima concentrazione le cellule non proliferano e rimangono in fase di quiescenza), un contenuto pieno di fattori di crescita e citochine, ma posso utilizzare anche fattori di crescita purificati. Il risultato è che posso osservare queste cellule tutti i giorni e posso amplificare la popolazione per avere una quantità sufficiente di materiale da studiare, poiché molti studi richiedono centinaia di milioni di cellule, quantità che non posso ottenere da una biopsia (asportazione chirurgica di un frammento di tessuto vivente per scopi diagnostici). Il sistema classico che prenderemo come riferimento è quello dei fibroblasti: se faccio una biopsia del tessuto sottocutaneo e la metto in coltura, i fibroblasti aderiscono alla piastra in coltura e cominciano a crescere finché non coprono tutta la superficie della piastra di Petri, perché quando le cellule sono a confluenza hanno la cosiddetta inibizione da contatto, cioè smettono di proliferare per effetto della citochina TGF-β e si arrestano fondamentalmente nella fase G1 del ciclo cellulare. E’ sufficiente che io tolga una parte delle cellule, una striscia di esse in maniera artigianale, per vedere che queste riprendono a proliferare fino a tornare allo stato di confluenza. Quindi, finché hanno spazio queste cellule proliferano, poi vanno incontro a questo meccanismo dell’inibizione da contatto che ha fatto capire molte cose in termini di regolazione del ciclo cellulare. Per i fibroblasti posso anche pensare di attuare un fenomeno di sincronizzazione, ovvero prendo i fibroblasti che stanno vivendo uno stesso momento funzionale del ciclo cellulare e vedo come si comportano in maniera sincrona, ovvero passando nelle stesso momento nelle stesse fasi del ciclo cellulare, perché la coltura di fibroblasti inizialmente è comunque una coltura eterogenea, cioè vi sono delle cellule che sono nelle varie fasi del ciclo cellulare, con alcune che sono in mitosi, altre sono in G1, altre sono in S, ed altre ancora possono essere in G2 o in G0. Sincronizzare vuol dire prendere solo alcune cellule che sono funzionalmente in una stessa fase del ciclo cellulare per poi studiare in modo sincrono tutte le fasi del ciclo. Solitamente i fibroblasti sono cellule adese, hanno tutte le placche focali di adesione, fanno adesione sia tra di loro che con il substrato (la plastica) perché cominciano a produrre delle proteine della matrice extracellulare che aderiscono sul fondo. Una cellula adesa riesco a staccarla solo con delle metodiche forti, mentre se invece lascio andare in mitosi i fibroblasti, la forma della cellula diventa rotondeggiante e praticamente perde la capacità di aderire, o perlomeno l’adesione diventa molto più modesta. Allora, con un sistema non molto raffinato riesco a recuperare le cellule in mitosi, posso anche solo prendere la piastra e scuoterla, tutte le cellule in mitosi possono così essere recuperate e riimpiastrate, così per alcuni cicli replicativi sono tutte sincronizzate. La sincronizzazione, quindi, mi permette di capire cosa succede nelle diverse fasi del ciclo cellulare. In generale questi fibroblasti fanno al massimo 30-50 cicli replicativi e poi muoiono, mentre le cellule tumorali sono in grado di vivere e proliferare anche a distanza di numerosi anni, per questo ques’ultime sono utilizzate maggiormente nelle ricerche.

Abbiamo visto dunque che anche la fase G1 e la fase G2, indicate con la sigla “gap” per identificare due intervalli di tempo di cui non si era ancora conociuto granchè da un punto di vista funzionale degli avvenimenti che li caratterizzavano, ora con le moderne tecniche del trascrittoma e del proteoma abbiamo raggiunto tutti le conoscenze per poter descrivere anche la fase G1 e la fase G2. Ma come possiamo studiare la proliferazione cellulare in generale, analizzandola in maniera globale? Con l’utilizzo della microscopia ottica siamo in grado di stabilire il primo parametro, ovvero l’indice mitotico, ovvero la percentuale di celllule che nell’insieme che stiamo considerando stanno andando in mitosi, attraverso il riconoscimento delle strutture subcellulari specifiche delle cellule in fase di mitosi sul preparato istologico da noi considerato. Questo è stato uno dei primi parametri della proliferazione cellulare che è stato studiato, e se consideriamo i nostri fibroblasti l’indice mitotico vale circa il 5-6 %. Il secondo parametro che andiamo ad analizzare è il tempo totale di ciclo, ovvero il tempo che impiega la cellula a fare un ciclo cellulare completo (nel caso dei nostri fibroblasti vale 24 ore), e viene effettuato attraverso un conteggio delle cellule in due determinati istanti di tempo, che valuta nel mio campione di quanto il numero di cellule è aumentato in un determinato intervallo di tempo. Questo conteggio può essere effettuato attraverso un contatore cellulare, dove le cellule passano attraverso attraverso un capillare, una ad una, ed al loro passaggio un raggio laser mi permette di contare queste cellule, altrimenti possiamo utilizzare le camere di Burker, sistemi più economici che si basano su un vetrino dove c’è una griglia di quadrettini aventi una superficie di un mm² dove vengono contate queste cellule e rapportate ai due istanti di tempo in cui abbiamo considerato le nostre cellule. Negli anni 70 è stata introdotta anche un’altra tecnica, chiamata labeling index, ovvero un indice di marcatura con timidina triziata che mi indica la percentuale di cellule presenti nella fase S, dove una timidina (rappresentante un nucleoside) è marcata con un idrogeno radioattivo, H3. Dopo aver inserito questo nucleoside nelle cellule che intendo studiare e dopo aver aspettato un periodo d’incubazione intorno alla mezz’ora, vedo che questo nucleoside è incorporato nelle cellule ed entra nel pool dei nucleotidi trifosfato, pronti ad essere utilizzati per la sintesi del DNA che procede regolarmente, e viene inglobato nel DNA solo in quelle cellule che sono attivamente presenti nella fase S. A questo punto laviamo via la timidina non entrata nel metabolismo cellulare (bisogna comunque stare attenti durante questo processo alla radioattività di questi elementi, in particolare attraverso l’utilizzo di guanti e comunque di tutti gli accorgimenti e le precauzioni del caso), poi faccio una centrifugazione blanda e vado a porre le mie cellule su un vetrino, fissate e sezionate per poterle osservare al meglio, a questo punto vado in camera oscura e vado a porre i mie vetrini in un’emulsione fotografica contenuta in vaschette per una notte, e succede che le cellule che hanno incorporato nel nucleo la timidina colpiscono l’emulsione fotografica con dei raggi β-molli che fanno precipitare nel nucleo i sali d’argento che sono presenti a livello dell’emulsione, poi lavo i vetrini dall’emulsione, vado ad utilizzare sul vetrino una soluzione di sviluppo (serve per ridurre gli aggregati di sali d’argento ionizzato in argento metallico, che essendo nero è responsabile della densità nell’immagine radiografica, infatti prima con la presenza di sali d’argento ionizzati avevamo ottenuto solamente un immagine latente da impressionamento (dovuta all’alterazione degli orbitali degli elettroni più esterni delle molecole presenti nel nucleo (la stragrande maggioranza è DNA) colpite dall’emissione dei raggi β-molli), ovvero il potenziale di un immagine visibile che appunto per essere visibile deve essere trattata con il trattamento chimico di sviluppo) e una soluzione di fissaggio (serve per fissare l’argento metallico appena ottenuto sull’immagine presente nel mio vetrino), poi torno a lavare le cellule e le vado a colorare. Quando vado ad osservare i vetrini al microscopio ottico, posso vedere numerosi pallini neri sul nucleo, circa un centinaio, che ci permettono di discriminare una cellula in fase S. Posso dunque definire questo indice come la percentuale di cellule in fase S, ed a livello dei fibroblasti questo valore è di circa il 45 %. Se lo confrontiamo con il numero di cellule in mitosi trovato in precedenza nei fibroblasti è un numero veramente esiguo, se però escludiamo qualsiasi errore e qualsiasi regolazione a questo livello che potrebbero aver alterato il processo, possiamo spiegare questi risultati perchè la fase S è decisamente più lunga (dura circa 8 ore) della fase M (che invece dura circa 45 minuti). Sapendo il tempo totale di ciclo, posso andare a calcolare la lunghezza in tempo di diverse fasi del ciclo cellulare, ad esempio se prendo 12 cellule e vedo che hanno 4 nuclei marcati in fase S, attraverso la formula che moltiplica il rapporto 4/12 per il tempo totale di ciclo dei fibroblasti, ovvero 24 ore, si arriva ad ottenere che la durata del ciclo della fase S nei fibroblasti è di circa 8 ore (lo faccio attraverso un discorso probabilistico, in quanto le cellule partono da fasi diverse del ciclo cellulare, in un elevato campione di cellule valuto quante sono caratterizzate dall’essere in una determinata fase e le rapporto al totale delle cellule ed al loro tempo totale di ciclo, secondo la proprorzione che in questo caso vale 12 : 4 = 24 : x), se voglio invece valutare la durata della fase M, guardo quanti cromosomi hanno delle marcature radioattive (in questo caso il trizio ha un tempo di decadimento notevolmente superiore ai nostri tempi di studio, si parla addirittura di decine di anni) e su 12 cellule noto che solo una presenta queste caratteristiche, dunque secondo la formula vista in precedenza vado a motiplicare 1/12 per le 24 ore ed ottengo 2 ore di tempo per la fase M, anche se per la maggior parte delle cellule la fase M dura 45 minuti. Posso anche calcolare la durata della fase di G2, controllando il tempo che impiegano i sali d’argento metallico a passare dalla fase S, dove sono visibili più o meno in tutto il nucleo, sui cromosomi a livello della fase M, e fatta una statistica delle cellule presenti in fase S e di quelle presenti in fase M, ottengo la lunghezza della fase G2 che è all’incirca di 2 ore, mentre la fase G1, sempre attraverso gli stessi meccanismi, vedo che arriva ad essere lunga fino a 12-14 ore. Con questa metodica posso anche calcolare il tempo totale di ciclo, ovvero vado a vedere il tempo di dimezzamento dei granuli di argento metallico che da 100 che sono in una cellula si trovano a diventare 50 nelle due cellule figlie: questo valore mi dice quano è lungo il tempo totale di ciclo.

In base a questi parametri, si è sempre pensato che i tumori fossero dati da un aumento dell’attività proliferativa celluare, ma al giorno d’oggi questa affermazione è stata sfatata perchè abbiamo notato che a volte i tumori più pericolosi proliferano molto meno delle cellule normali, non tutti i tumori hanno dunque un’elevata attività proliferativa, ma possono presentarsi come blocchi differenziativi o blocchi del processo di apoptosi, che non permettono alla cellula di andare incontro alla morte cellulare. È importante capire la biologia del tumore, perchè in questo caso in tumori che non danno luogo a fenomeni di proliferazione cellulare si devono usare farmaci differenzianti o proapoptotici, mentre se uso farmaci antiproliferanti, essendo in questo caso le cellule normali più proliferanti delle cellule tumorali, posso andare a causare dei danni notevoli sulle cellule normali.