Geni oncosoppressori

Nella categoria dei “players” che impediscono alla cellula di proseguire nella fase S dobbiamo metterci anche i geni oncosoppressori, che rappresentano delle proteine particolari in grado di inibire la proliferazione cellulare, tra cui citiamo il gene che dà origine alla proteina RB e il gene che origina la proteina P53. Il gene RB è stato chiamato così perché è stato isolato in un tumore particolare, il retinoblastoma (sappiamo infatti che il tumore è una patologia che può presentare dei contesti cellulari molto diversi, infatti possiamo distinguere fino a 100 malattie diverse che possiamo definire come tumori, anche se non è chiaro perchè una delezione al gene RB si sia trovata prevalentemente nei retinoblastomi), che si localizza sul braccio lungo (struttura più lunga che si estende dal centromero) del cromosoma 13 e come anche gli altri geni oncosoppressori viene attivato per delezione, quindi quando succede qualcosa per cui questo gene viene deleto, esso inizia a dare dei problemi, dal punto di vista genetico però gli antioncogeni sono recessivi, cioè per la formazione di un tumore non è sufficiente la delezione di un allele ma tutti e due gli alleli devono essere distrutti o comunque inattivi dal punto di vista funzionale, infatti nel retinoblastoma abbiamo la delezione sia del primo allele che dell’altro allele. Questo tumore è abbastanza frequente perché è possibile che si trasmetta per via ereditaria, infatti da due genitori apparentemente sani, ma che hanno un allele deleto, potranno nascere figli in cui il gene RB, con mutazioni che possono avvenire facilmente sul gene sano (ma potrebbe anche nascere già con i due alleli in forma deleta), potrà dare origine a un tumore.

Possiamo andare a studiare la struttura del gene RB perché è un gene particolare, notiamo infatti nella figura alcune “box” nere che rappresentano gli esoni, notiamo anche il codone AUG, il sito di inizio della traduzione, che si trova verso la fine del primo esone e quindi la prima parte del primo esone non viene tradotta, infatti questa porzione nucleotidica è presente nel mRNA ma non c’è nella proteina, quindi possiamo dire che il 5’ non viene tradotto, si parla in particolare di regione 5′-UTR, mentre possiamo notare a monte la regione promotrice di questo gene. Sono presenti 27 esoni e 25 introni (di cui due piuttosto lunghi che rappresentano un punto di debolezza del DNA) per tutto il gene, inoltre possiamo dire che questo gene occupa uno spazio molto grande nel DNA, è costituito infatti da una sequenza di circa 10’000 nucleotidi in una regione di DNA di almeno 200’000 nucleotidi. Anche la proteina che codifica per il gene RB è molto grande, infatti è composta da 928 amminoacidi. Se passiamo allo schema della proteina notiamo innanzitutto la regione N-terminale e la regione C-terminale, poi se entriamo nello specifico vediamo diversi domini funzionali, in particolare individuiamo tre domini di interazione con le proteine (Protein-Protein Interaction), in cui possiamo avere il legame con la proteina SV40 o con un fattore di trascrizione importante come E2F (si possono legare fino a 150 proteine su questa proteina RB), vediamo diversi siti di fosforilazione (in ogni caso questa è una proteina che funziona se è defosforilata, in particolare è organizzata in regioni specifiche che formano delle tasche che possono interagire con altre proteine, quando però questa proteina viene fosforilata in una di queste tasche non lega più le proteine che prima manteneva legate, il fatto che RB sia fosforilata è infatti una condizione per passare alla fase S) ed anche una regione di legame al DNA che però non funge da fattore trascrizionale.

Nella proteina RB possiamo trovare dunque tre tasche, ovvero una regione N-terminale, una regione C-terminale ed una regione centrale che legano diverse proteine, in particolare possiamo dire che RB funziona come una spugna molecolare, cioè è in grado di interagire con tante proteine diverse semplicemente legandole a sè. RB è in grado di interagire e legare più di 150 proteine diverse se è defosforilata, se si ha infatti un evento di fosforilazione in una di queste tasche RB non è più in grado di legare la proteina corrispondente, quindi RB può essere messo fuori gioco parzialmente o totalmente a seconda che venga fosforilato in una regione o in tutte le regioni che la costituiscono. Se torniamo allo schema del ciclo cellulare è chiaro che nella transizione G1-S, la proteina RB deve essere fosforilata perché se non è fosforilata pone dei problemi andando a legare delle proteine, impedendo il passaggio della cellula attraverso la transizione G1-S. Tra le proteine legate da RB, ci sono alcune proteine come c-MYC che se viene legata blocca la cellula in G1, oppure se vengono legate le cicline D, la cellula si blocca sempre in G1. Un altro fattore trascrizionale importante per la fase di duplicazione del DNA è E2F, che induce l’attività di una serie di geni comprese le DNA polimerasi, ma se RB lo lega questo fattore trascrizionale non funziona. Qual’è dunque il meccanismo che si attiva nella transizione G1-S relativo al rapporto tra le cicline D e RB? Si viene ad instaurare una competizione diretta perchè se si forma prima il complesso cicline D-CDK (CDK1 o CDK4) la prima cosa che fa la chinasi è fosforilare la proteina RB, mettendola fuori gioco, ma se RB funziona prima del complesso CDK-ciclina sottrae le cicline D (che sono presenti già in cospicue quantità sin dall’inizio della fase G1) andandole a legare e in questo modo non si forma più il complesso con la chinasi, quindi la cellula si blocca in G1.

Se andiamo ad analizzare la proteina P53, sappiamo che è prodotta da un altro gene oncosoppressore, avente un peso molecolare di 53 kD (l’unità di misura è il Dalton), e fa parte di una famiglia di proteine che hanno una funzione di controllo negativo sulla proliferazione cellulare, ed è molto importante nelle trasformazioni tumorali perchè lo troviamo mutato nel 30 % dei tumori che andiamo ad analizzare, in particolare se vengono delete alcune zone di questo gene sono responsabili dell’insorgenza di diversi tumori come la sindrome di Li Fraumeni che porta ad uno sviluppo di cancro alla mammella o al polmone. Da un punto di vista strutturale vediamo come esso è un gene che possiede 11 esoni e 10 introni più o meno lunghi, anche se possiamo vedere come il primo esone non venga tradotto perché non è presente il codone AUG all’inizio della sequenza, mentre la traduzione inizia a partire dal secondo esone. L’undicesimo esone, invece, ha il codone di stop prima della fine dell’esone stesso e quindi non verrà codificato del tutto. È un gene più semplice e più compatto di RB perche è contenuto in una porzione molto più piccola di DNA, vediamo però che la struttura della proteina è più complicata di RB benché abbia 393 anzichè 928 amminoacidi. Da un punto di vista proteico possiede diversi siti di fosforilazione in serina e treonina al C-terminale e all’N-terminale e contiene principalmente tre domini, ovvero un dominio centrale di “binding” al DNA (DNA Binding Domain), un dominio N-terminale di transattivazione (che può funzionare da fattore di trascrizionale) e un dominio C-terminale di oligomerizzazione, infatti può andare a formare un tetramero che si avvolge attorno al DNA fungendo da sensore per gli errori di “missmatch” che si possono trovare sulla stessa catena di DNA. A differenza di RB e altri geni oncosoppressori però è dominante, per spiegare questo concetto dobbiamo dire che questa proteina funziona come un tetrametro, infatti ci sono 4 proteine che si mettono insieme per formare questo tipo di struttura, quindi vanno incontro ad un processo di oligomerizzazione, se tutti e due gli alleli sono mutati, il tetrametro non funziona più, ma il tetrametro funziona male anche se c’è un solo allele alterato e uno normale, basta quindi che nella composizione dell’oligomero entri la forma mutata che l’oligomero stesso non va più ad agire nel nucleo. Come fattore trascrizionale, attraverso il dominio di transattivazione, può attivare la trascrizione di altri geni, ad esempio può indurre la trascrizione della proteina P21 che come abbiamo visto è una CDK I e funziona andando a disattivare il complesso CDK-ciclina attivo, e sempre attraverso la P21 è in grado di bloccare la cellula in G1 andando a sostituirsi alla subunità γ della DNA polimerasi, impedendo alla duplicazione del DNA di andare avanti. Sempre attraverso la proteina P21, la proteina P53 promuove anche l’apoptosi perché si ha la trascrizione di geni proapoptotici come BAX, FAS e altre proteine, quando sono troppi gli errori presenti sulla catena del DNA che non riescono ad essere riparati prima di terminare la duplicazione del DNA.

Quindi le funzioni del gene P53 sono quella di bloccare la cellula in fase S come inibizione della replicazione del DNA, come repressione trascrizionale dell’apparato di base della trascrizione, è efficiente nel riparo del DNA, poi sempre con la proteina P21 induce il differenziamento cellulare, perché uno dei requisiti del differenziamento è che la cellula sia bloccata in fase G1, inoltre è un gene proapoptotico e come poteina ha anche un dominio di legame sul DNA. Quindi abbiamo visto che un punto importante dell’azione della proteina P53 è che viene svolta a livello nucleare, infatti gli anatomo-patologi, studiando diversi tumori con anticorpi antiP53 avevano notato che in molti tumori la proteina P53 rimaneva nel citoplasma e non andava al nucleo. In questi tumori in cui la proteina rimaneva nel citoplasma hanno sequenziato la proteina P53 e il gene che codificava per questa poteina, e hanno notato che il gene era mutato, quindi c’è una corrispondenza tra il livello mutazionale di P53 e la sua traslocazione, che compromette la sua funzione nucleare. Ma come funziona nel nucleo P53? Funziona in vario modo, come sistema di riparo del DNA funziona quando ci sono dei “missmatch” nella maniera già descritta prima, in particolare quando c’è questa situazione il DNA non è appaiato bene ma forma una specie di bolla, a questo punto allora la P53 sottoforma di tetrametro circonda il DNA e ci scorre sopra. Quando la P53 incontra una regione con un appaiamento sbagliato di basi se ne accorge e (siamo in fase S) chiama la P21, una CDK I che ha una stechiometria molto simile alla subunità γ della DNA polimerasi, va infatti ad infilarsi al suo posto dentro alla struttura della DNA polimerasi. In questo modo blocca l’attività della DNA polimerasi per un un tempo breve, perché la P21 ha un’emivita di circa 45 minuti, ma sufficiente per attivare i meccanismi di riparo del DNA che tagliano e riparano i due nucleotidi che si sono appaiati male. Quindi, la P21 non funziona direttamente come meccanismo di riparo del DNA, ma blocca la DNA polimerasi per un certo periodo di tempo e permette ai meccanismi di riparo del DNA di riparare gli errori di missmatch. Se però il danno è troppo elevato e non si può riparare, la proteina P53 induce la trascrizione di altri geni come BAX e FAS che portano la cellula in apoptosi.

Un danno al DNA non si verifica però solamente nella fase S, infatti se c’è un alterazione dell’equilibrio di ossidoriduzione dei radicali liberi dell’ossigeno (quindi o lo ione superossido oppure altri radicali liberi dell’ossigeno come lo ione ossidrile diventano maggiomente concentrati nella loro forma più pericolosa) si danneggia la catena di DNA, ma anche P53 è sensibile ai radicali liberi dell’ossigeno e può riparare questi tipi di danni. Il DNA quindi può essere danneggiato anche in fase G1 e se è danneggiato P53 induce la trascrizione della P21 che blocca le cicline (D ed E) della fase G1.