Fattori di crescita emopoietici

Per quanto riguarda le citochine che regolano l’emopoiesi, vediamo che esse vanno a regolare la produzione delle cellule del sangue. In particolare se iniziamo ad osservare un preparato di midollo osseo, vediamo come si possano vedere trabecole ossee e dentro a queste trabecole è presente questa enorme quantità di cellule che possono essere identificate: ci sono tutte le cellule del sangue che vengono prodotte dal midollo più tutte le cellule stromali (fibroblasti, adipociti, vasi, cellule endoteliali), mentre i fattori di crescita emopoietici utilizzati a questo livello possono essere prodotti da vari tipi cellulari, in particolare cellule stromali, fibroblasti e cellule endoteliali producono una serie di fattori di crescita emopoietici, che sono IL-1, IL-6 e GM-CSF (Granulocite Monocite Colony Stimulating Factor), mentre altri fattori di crescita come G-CSF e M-CSF sono prodotti dai monociti, dai macrofagi o dai linfociti T. Tutti questi fattori di crescita agiscono fondamentalmente con un meccanismo paracrino, cioè all’interno del tessuto emopoietico del midollo osseo. Alcuni hanno un’azione monolineare, cioè funzionano solo su una filiera (tipo sui granulociti e i monociti), altri sono multilineari (come il G-CSF e l’M-CSF), mentre altri hanno anche un’azione mista. Abbiamo altri fattori di crescita prodotti dalle cellule renali, che producono due importanti fattori di crescita: uno è la eritropoietina (EPO), l’altro è la trombopoietina, che favorisce la proliferazione dei precursori piastrinici (megacarioblasti e megacariociti). Queste due citochine agiscono con meccanismo ormonale perché sono prodotte dal rene e poi vanno ad agire sulle cellule del sangue.

Tra le componenti staminali del midollo osseo abbiamo la cellula staminale ematopoietica, avente una forma molto simile a un piccolo linfocita, quindi non sono facilmente riconoscibili, e rappresentano circa lo 0,5 % delle cellule presenti nel midollo osseo. Questa cellula è multipotente e dà origine a 8 citotipi differenziati, che possiamo notare nel midollo osseo, pieno sia di cellule già differenziate che di quelle in via di differenziamento. Abbiamo anche la cellula staminale mesenchimale, che può dare origine ad adipociti, condrociti, osteoblasti e fibroblasti, dunque già attraverso queste due cellule staminali notiamo come il midollo osseo non sia eterno e debba infatti essere ricambiato costantemente nei suoi elementi cellulari. Inoltre è presente anche una terza cellula staminale, l’emoangioblasta, il precursore delle cellule endoteliali, rappresentante la cellula staminale meno identificata, che si pensa si trovi a contatto con i periciti, cellule che probabilmente rappresentano la cellula staminale mesenchimale. Questa descrizione mi permette di dire che alla base ci stà il fatto che tutti i tessuti del corpo vengono ricambiati, infatti con la vecchiaia questi processi tendono a perdere la loro efficienza, l’invecchiamento è infatti la perdita della capacità di autorinnovarsi da parte dei tessuti. Infatti si accumulano col tempo mutazioni che possono provocare dei danni che si ripercuotono su questi processi, che addirittura possono dare origine a situazioni neoplastiche, inoltre in questo ruolo dell’invecchiamento giocano un ruolo molto importante anche i telomeri, le estremità cromosomiche che permettono ad ogni replicazione di DNA che tutto il DNA funzionale venga replicato, senza la perdita di alcuna sequenza nucleotidica.

Le NICCHIE sono localizzazioni importanti delle cellule staminali, che a livello del midollo osseo possono essere di diversa natura, in particolare quando la cellula staminale emopoietica entra in contatto con gli osteoblasti dà origine alla nicchia osteoblastica, poi abbiamo la nicchia vascolare in cui la cellula staminale viene in contatto con le cellule endoteliali (quando la cellula staminale viene a contatto con le cellule endoteliali può diventare un megacarioblasto, in seguito si differenzia in un megacariocita e successivamente può dare origine alle piastrine. Nella logica tutto questo è molto interessante perché il megacariocita in questo caso è attaccato alla cellula endoteliale, poi infila dentro diversi prolungamenti citoplasmatici nel vaso e diverse porzioni di questi prolungamenti si staccano per andare a lavorare nella circolazione sanguigna come piastrine) e la nicchia stromale che viene effettuata con i fibroblasti (in questo caso si parla di isolotto eritroide, dove le cellule staminali che vanno incontro al differenziamento in eritrociti vanno incontro inizialmente alla picnosi (contrazione del nucleo) e alla carioressi (frammentazione del nucleo) del nucleo, poi si pensa che la cellula vada in apoptosi ma butta fuori il nucleo e rimane nella forma costitutiva di un reticolocita (eritrocita giovane in cui rimangono alcuni ribosomi (quelli che avevano prodotto in precedenza in maniera massiva l’emoglobina) che si depositano e sono visibili come una sorta di reticolo proprio nelle prime fasi di vita dell’eritrocita): in questi microambienti sono le cellule stromali ad essere considerate come le cellule effettrici, in grado di produrre citochine o fattori di crescita emopoietici, che rappresentano stimoli microambientali che arrivano sulle cellule bersaglio e ne regolano l’attività, inoltre però questi fattori di crescita possono anche agire con meccanismo endocrino, tipo i fattori di crescita prodotti dai reni, l’eritropoietina e la trombopoietina, inoltre bisogna tenere in considerazione che queste citochine possono avere un effetto multilineare (agiscono su differenti tipi di precursori per portarli al differenziamento), un effetto monolineare (questi fattori di crescita operano specificatamente per una singola filiera emopoietica) o un effetto misto (sono fattori di crescita che hanno un ampio spetttro di azione su differenti precursori ma hanno una limitata attività stimolante per la proliferazione dei precursori). In questa maniera diciamo alle cellule staminali quello che devono fare. Queste cellule staminali poste nella nicchia si caratterizzano anche per il fatto che si trovano agganciate attraverso sistemi di adesione cellulare con le cellule adiacenti, ma anche attraverso sistemi di adesione cellula-matrice in quanto siamo comunque presenti in una matrice, e questi sono specifici in base alla nicchia che stiamo coniderando. Quando la cellula svolge minime attività metaboliche si parla di cellule staminali in quiescenza, e si dice che sono cellule staminali a lunga sopravvivenza, esse infatti rappresentano il “pool di storage”, ma se questa cellula viene soggetta a degli stimoli può andare incontro a proliferazione attraverso una divisione simmetrica, che permette l’origine di due cellule che tendono ad andare a svolgere la stessa funzione, oppure si parla di una divisione asimmetrica quando si ha una diversa distribuzione delle componenti citoplasmatiche, in questo modo infatti non si perde la caratteristica di staminalità, in quanto rimane comunque in almeno una cellula il carattere di staminalità (può accadere anche nella divisione simmetrica se parliamo di due cellule staminali che vanno incontro ad un processo di autorinnovamento). Questi processi naturalmente sono legati a diversi stimoli, ed è per questo che hanno una notevole importanza in campo terapeutico, per poter sviluppare nuove terapie contro diverse malattie, ad esempio scoprendo quali citochine o fattori di crescita favoriscono il differenziamento della cellula staminale, oppure si è parlato anche dello Stem Cell Nich Theraphy, ovvero un prototipo di studio che mi permette di dire che se aumento la componente della nicchia staminale aumento anche l’attività delle cellule staminali, e viceversa dovrebbe succedere il contrario se diminuisco i componenti della nicchia staminale.

Ricordiamo ora le PROPRIETÁ DELLA CELLULA STAMINALE EMOPOIETICA, tra cui ricordiamo il self-renewal o autorinnovamento, che descrive un concetto solamente funzionale, non descritto dal punto di vista biologico, poi abbiamo il commitment, che rappresenta la scelta della linea differenziativa, e questo è un processo sufficientemente chiaro ma anche altrettanto importante, in quanto sappiamo che la concentrazione di queste cellule nel nostro corpo è sempre stabile, poi abbiamo l’engrafment, ovvero il processo attraverso cui si ha un’adesione cellulare sulle componenti del midollo osseo, ed è molto importante nei trapianti di midollo osseo, in più abbiamo la developmental plasticity, che tiene conto della capacità della cellula staminale ematopoietica di dare origine a cellule di linee diverse, ma si è visto che è più un processo occasionale dovuto alla fusione della cellula staminale con un neurone o un epatocita, che gli permette così di dare origine a una cellula di una linea diversa, appunto un neurone o un epatocita, ma è un processo altamente inefficiente.

Una volta prelevate da uno dei vari distretti posso mettere in coltura queste cellule staminali e realizzarne la fase di commitment, ovvero quel processo con cui vado a scegliere la linea differenziativa.  Quindi queste cellule vanno in differenziamento, diventano cellule CD34 negative e CD38 positive dopo una settimana, in quanto stanno perdendo il loro carattere di staminalità, poi dopo 15-20 giorni posso ottenere dei granulociti, dei monociti o dei macrofagi, comunque cellule aventi già marcatori specifici che risiedono in particolari cellule ematopoietiche già differenziate. Quando però la cellula staminale non si è ancora differenziata, in particolare posso distinguere una popolazione di cellule staminali aventi un marcatore di linea (tipo la glicoforina per i globuli rossi) assieme alla proteina di superficie CD34, che rappresenta una cellula che stà vivendo la sua prima fase di differenziamento, mentre una popolazione quiescente non possiede neanche la proteina di superficie CD34, mentre le cellule proliferanti possiedono solo la proteina di superficie CD34 senza i marcatori di linea. Posso anche andare a riconoscere gli elementi circolanti nel sangue periferico, ad esempio con una microfotografia (immagine fotografica di oggetti molto piccoli ingranditi, ottenuta per mezzo di un microscopio che sostituisce l’obiettivo), oppure possiamo riconoscerli semplicemente andando ad analizzare al microscopio uno striscio di sangue. Per recuperare le mie cellule differenziate vado invece ad utilizzare particolari meccanismi, ad esempio i megacarioblasti li recupero attraverso un anticorpo anti CD41, un recettore posto sui megacarioblasti, oppure attraverso un anticorpo anti CD14 posso recuperare i monociti, diversificandoli dalle cellule granulocitarie. I monociti sono dunque cellule CD14 positive, i granulociti neutrofili sono cellule CD16 positive, mentre i granulociti eosinofili sono negativi per questa proteina, ma anche i granulociti basofili siamo riusciti a separare nonostante le sue basse concentrazioni nel sangue.

Queste cellule staminali che stiamo analizzando possono essere prelevate ad esempio grazie al fatto che conosciamo che CD34 è una proteina di superficie caratteristica delle cellule staminali emopoietiche che lega probabilmente molecole appartenenti alla matrice, infatti posso utilizzare degli anticorpi specifici nei confronti di questa proteina di superficie, e li lego a delle minuscole biglie immunomagnetiche che posso recuperare con un magnete, ad esempio con una calamita: il risultato è una purificazione al 99 %. Queste cellule staminali emopoietiche possono essere prelevate anche dal sangue periferico (dove sono presenti in bassissime quantità, circa lo 0,06 % rispetto alle celllule mononucleate presenti nel sangue), dal cordone ombelicale dove sono presenti cellule fetali che oggi sono depositate in apposite banche per futuri utilizzi di trapianto in caso sopratutto di linfomi o mielomi, sia per il nascituro che per chiunque ne avesse bisogno, secondo diverse modalità di donazione che possono essere effettuate, nel caso non servissero in questo ambito verrano poi date ai settori di ricerca, infatti queste cellule sono molto importanti perchè possono dare origine anche alle cellule staminali mesenchimali. Queste cellule staminali ematopoietiche possono trovarsi anche nel midollo osseo, presenti a questo livello in concentrazioni che vanno dall’uno al tre per cento delle cellule presenti nel midollo osseo.

Ricapitolando, passiamo da una cellula staminale quiescente attraverso specifiche citochine (ne esistono però anche in grado di bloccare l’attività della cellula staminale) per arrivare ad una cellula staminale proliferante che va incontro poi alla differenziazione, che inizialmente individuiamo nella formazione di particolari cellule chiamate precursori, e in particolari topi transgenici (dove abbiamo overespresso un gene) e topi “knockout” (dove abbiamo inattivato un gene) si è scoperto il meccanismo di questo processo, in pratica le molecole che dirigono questa scelta sono i fattori trascrizionali, proteine che si dirigono al nucleo e si rapportano con i geni che devono essere regolati da un punto di vista funzionale. Da queste proteine posso dunque avere legami sinergici o antagonisti che ne permettono la loro reciproca relazione, indirizzando la cellula staminale a percorrere una linea differenziativa piuttosto che un’altra, e tutto questo rappresenta un meccanismo probabilistico. Ma dove agiscono questi fattori di crescita? Interagiscono a livello dei precursori, e non sulle cellule staminali indifferenziate (o almeno vi agiscono molto meno, in maniera molto meno efficiente) perchè le cellule staminali hanno pochissimi recettori mentre i precursori ce ne hanno molto di più di questi recettori che attivano la specifica via di trasduzione del segnale.  Vado ad utilizzare questi fattori di crescita in campo terapeutico nei dializzati (chi va incontro ad un processo di depurazione del sangue dalle scorie e dalle impurità) cronici, in alcuni casi di anemia o anche dopo delle chemioterapie di tumori solidi, perchè c’è un danno notevole alle cellule emopoietiche, sia della linea mieloide che della linea linfoide, ma non posso utilizzarli nei linfomi o nelle leucemie, in quanto siamo in presenza di cellule staminali ematopoietiche tumorali, che vanno ad occupare un po’ tutti i siti di nicchia nel midollo osseo ed agiscono in maniera incontrollata.

Ho quindi ottenuto tutti i contesti cellulari per andare a studiare quello che mi serve, ad esempio attraverso l’immunofenotipo (sappiamo essere la caratterizzazione delle proteine di superficie di una cellula attraverso degli specifici anticorpi marcati con un fluorocromo, infatti nell’emopoiesi riesco a caratterizzare le diverse filiere proprio attraverso questo meccanismo, ad esempio in leucemie e linfomi quando ci sono delle cellule che sono morfologicamente diverse da quelle presenti in un individuo sano, le riesco a riconoscere attraverso i suoi marcatori di superficie, inoltre questo processo viene fatto anche per capire se i linfociti sono tutti uguali o tutti diversi, per capire se c’è stata una proliferazione clonale, perchè se è presente, nel 99% dei casi essa è un tumore, altrimenti è una proliferazione di linfociti tutti uguali che deriva da uno stimolo antigenico), un’analisi morfologica delle cellule al microscopio ottico, un saggio clonogenico, un profilo di espressione attraverso l’utilizzo di DNA microarrays (sappiamo che studiano in particolare gli mRNA esprimibili da una cellula), un sequenziamento del genoma cellulare o lo studio del suo proteoma, posso trattare queste cellule con particolari farmaci e valutarne la loro risposta ma posso anche fare di più attraverso la cosiddetta “Sistem Biology”, basata sul principio che se aumento o blocco l’espressione di un gene (si parla di interferenze che vado ad operare sulla cellula staminale), vado a vedere l’importanza di questa azione sulla biologia della cellula staminale emopoietica, andando a valutarne gli effetti.