Fasi della Mitosi

La mitosi è un processo estremamente controllato. Il controllo dei meccanismi di proliferazione, sostentamento e apoptosi è cruciale per il mantenimento dell’equilibrio nel tessuto tra cellule che si dividono, cellule che non si dividono (e sono le quiescenti o staminali che provvedono alla rigenerazione del tessuto danneggiato) e cellule invecchiate che muoiono per apoptosi.
I processi che regolano la proliferazione sono gli stessi in tutti gli eucarioti. Le fasi del ciclo cellulare sono la fase G1, in cui avviene un marcato accrescimento della cellula, che sintetizza componenti strutturali ed enzimi per la duplicazione del DNA. Nella fase S si ha duplicazione del DNA e sintesi di proteine cromosomiche, nella fase G2 si ha la sintesi di proteine necessarie per la mitosi, nella fase M si ha la segregazione dei componenti citoplasmatici e del materiale nucleare in due cellule figlie, e dura circa 80 minuti sulle 24-48 ore del ciclo cellulare.

Nella fase G1 c’è un accrescimento della cellula che sintetizza i componenti anche per la fase S, in cui si ha la duplicazione del DNA e la sintesi delle proteine istoniche e non istoniche, che assemblano la cromatina. In G2 si ha la sintesi di proteine necessarie alla mitosi, e nella fase M avviene la segregazione dei componenti cellulari e nucleari nelle due cellule figlie. Il ciclo cellulare è una serie ordinata di eventi che portano alla duplicazione cellulare. La fase M rispetto alla durata di tutto un ciclo cellulare (24-48 ore) dura relativamente poco, circa 80 minuti. La variabilità di durata del ciclo cellulare dipende dalla fase G1 e G2 del ciclo cellulare, perché anche la S è molto breve, dura circa mezz’ora o un ora.

Nella profase si ha la condensazione cromatinica e il disassemblaggio del citoscheletro, nella prometafase si ha invece il disassemblaggio dell’involucro nucleare, grazie al disassemblaggio della lamina A e B che normalmente sostiene in interfase la membrana nucleare interna. Si ha l’attacco dei cromosomi ai microtubuli del fuso, formati dai microtubuli e dal cinetocore, mentre i microtubuli collegano i cinetocori ai poli delle cellule. Questi microtubuli sono anche detti polari, provengono dai poli e si sovrappongono sul piano equatoriale, i cromosomi si attaccano infatti ai microtubuli del cinetocore. In mitosi, ciascun polo contiene un MTOC (centro di organizzazione dei microtubuli). Dai centrioli dell’MTOC si irradiano i microtubuli che formano il fuso. A ciascun centromero è associato un cinetocore, che serve come punto d’attacco per i microtubuli. È come se servisse una fune per i cromosomi per trascinarli alle parti opposte delle cellule.

Nella metafase i cromosomi si allineano sulla piastra metafisica mentre i cinetocori mantengono uniti i cromosomi fratelli, durante l’anafase i due cinetocori su ogni cromosoma si separano e i cromosomi sono tirati alle parti opposte della cellula.


Avviene una crescente separazione tra i 2 poli del fuso per allungamento dei microtubuli polari, mentre i microtubuli del cinetocore si accorciano. I microtubuli del cinetocore si accorciano perché hanno già tirato i cromosomi ai poli mentre quelli polari che servono per la divisione si allungano. Nella telofase i cromosomi segregati arrivano ai poli. I microtubuli del cinetocore scompaiono completamente. I microtubuli polari si allungano ancora accentuando la separazione tra i poli. L’involucro nucleare si riforma attorno ai cromosomi separati. La cromatina si decondensa e riappaiono i nucleoli. Infine nella citochinesi avviene la separazione fisica tra le due cellule tramite un anello contrattile che comincia a restringersi causando un solco di divisione.

La regolazione della progressione durante il ciclo cellulare è affidata a proteine cinasi eterodimeriche, composte da una subunità catalitica di tipo cinasico (CDK, attiva solo con la ciclina) e da una regolativa (MPF è la proteina cinasi eterodimerica che regola la fase M). Queste due si dimerizzano per formare il complesso attivo. Le subunità regolative sono dette cicline, poiché il loro livello di espressione oscilla in modo specifico durante le fasi del ciclo cellulare. La subunità catalitica presenta un’attività cinasica che è dipendente dall’associazione con la ciclina, da cui il nome CDK (cyclin dependent kinase), ovvero “cinasi dipendente dalla ciclina”. È attiva solamente quando è attivata la ciclina. A loro volta l’attività dei complessi CDK/cicline è controllata da eventi fosforilativi e dall’associazione con proteine regolatrici.

Negli eucarioti inferiori (quali i lieviti) una singola CDK (Cdc2 o Cdc28) regola le varie transizioni del ciclo cellulare associandosi sequenzialmente a cicline di G1, cicline della S e della M. Nei mammiferi invece esiste un’intera famiglia di CDK che regolano la progressione attraverso il ciclo mediante l’associazione con le cicline di G1, S e M . Per i mammiferi la proliferazione cellulare è regolata dal microambiente e la proliferazione cellulare è stimolata solamente quando l’organismo ha bisogno di quel tipo di cellula. Solo in presenza dei segnali che stimolano la proliferazione si ha l’entrata e la progressione nel ciclo della cellula. Le cellule se non vengono stimolate esistono solamente in uno stato funzionale quiescente, che non è una fase del ciclo anche se è chiamato G0. In G0 sono posizionate le cellule che hanno un metabolismo basale al minimo, non si stanno dividendo e quindi non fanno questo circuito. Una cellula quiescente può però essere reclutata in ciclo in seguito alla stimolazione di fattori di crescita.


La cellula staminale, ad esempio, può essere reclutata in ciclo quando c’è bisogno di rigenerare cellule in un determinato tessuto. La stimolazione di cellule quiescienti (in G0) da parte di fattori di crescita, induce la trascrizione dei geni di risposta ai fattori di crescita (ad esempio le cicline D) e quindi l’entrata in ciclo. Le cicline D sono le molecole che intervengono nella fase G1, nel passaggio che la cellula quiescente deve fare tra G0-G1. La transizione di questa fase è l’entrata in ciclo. Dopo stimolazione dei fattori di crescita vengono indotti i geni di risposta ai fattori di crescita e la cellula entra nel ciclo passando esclusivamente da G0 a G1.

 

Come avviene la progressione nelle varie parti del ciclo?

Per progredire nella fase G1 bisogna effettuare tutte quelle sintesi necessarie per eseguire la fase G1: nella fase G1 c’è un forte accrescimento della cellula e una forte sintesi delle proteine che servono per la fase S. La progressione attraverso G1 avviene grazie all’intervento delle proteine cinasi, i complessi eterodimerici che nei mammiferi sono formati da cdk4 e cdk6 e dalle cicline D. Grazie all’attività cinasica di questi complessi la cellula può man mano completare le funzioni e le sintesi richieste nella fase G1. La cellula quindi procede durante il ciclo fino ad un punto chiamato PUNTO DI RESTRIZIONE. Nel punto di restrizione si forma un altro complesso che comprende cdk2 e ciclina E, appena prima della transizione G1-S. Il punto di restrizione è molto importante perché superato questo la cellula non ha più bisogno della stimolazione da parte dei fattori di crescita per dividersi. La cellula ha bisogno di trascrivere dei fattori di crescita per fare questo percorso G0-G1 ma ha bisogno ancora di fattori di crescita per progredire attraverso G1 ed arrivare alla fase finale di G1, ovvero al punto di restrizione. Se vengono rimossi i fattori di crescita la cellula torna ad essere quiescente e non va a dividersi.

Successivamente al punto di restrizione la cellula si divide e procede meccanicamente, guidata attraverso eventi regolativi nella fase S, G2 e M. Si forma, dopo il punto di restrizione, il complesso cdk2 – ciclina E, avviene la transizione G1-S e in S avviene la sintesi del DNA. Nelle nostre cellule esiste un gene che si chiama RB che può essere mutato in retroblastoma che normalmente ha una funzione nell’inibire la proliferazione cellulare. Se questo gene viene inattivato si va verso il cancro perché la proliferazione avviene incontrollata. RB si associa ad un fattore trascrizionale E2F, che attiva la trascrizione dei geni che attuano la duplicazione del DNA (enzimi come la DNA polimerasi), ovvero degli enzimi che sono attivi nella fase S. Nel G1, RB sequestra E2F e lo tiene legato a sé, rendendolo inattivo. Questo avviene quando non sono attivi i complessi ciclina D ,cdk4 e cdk6. Quando diventano attivi questi complessi fosforilano RB. RB nella sua forma fosforilata si dissocia da E2F, che viene rilasciato consentendo la proliferazione della fase G1, perché vengono sintetizzati, grazie all’azione di E2F, gli enzimi necessari per la fase S e la cellula completa tutte le attività che deve svolgere in G1, tra le quali c’è la preparazione per la fase S.

Nelle cellule normali dove RB non è inattivato, RB viene fosforilato da cdk e cicline del G1 per permettere il passaggio G1-S, poi viene defosforilato alla fine della M perché c’è un momento in cui gli enzimi della fase S non devono essere sintetizzati. Quando la cellula è in S c’è un altra ciclina, la A, a cui cdk1 si unisce e permette la progressione in S alla cellula. Alla fine della fase G2, le cicline A e B cominciano ad associarsi a cdk1 formando MPF, (mythosis promotive factor), la cui attività comincia alla transizione interfase/profase, raggiunge il massimo in metafase ed inizia a diminuire all’inizio dell’anafase. Ogni fase del ciclo cellulare è quindi regolata da specifici complessi cdk-cicline, che permettono il passaggio della cellula in quella fase e preparano la cellula per il passaggio da quella fase a quella successiva e fanno si che la cellula possa completare le funzioni e sintesi tipiche della specifica fase.

La regolazione della mitosi è affidata ad un complesso eterodimerico formato da cdk1 (chiamato anche cdc2 perché è l’omologo del lievito) con ciclina A o ciclina B, difatti quando questi due tipi di complessi si associano, assicurano, tramite la loro attività cinasica (ovvero fosforilante), l’innesco di tutte le attività di fosforilazione che avvengono in mitosi e quindi tutti gli eventi mitotici. Entrando più nel dettaglio possiamo osservare che il complesso cdk1 – ciclina A-B, che fu scoperto molto prima degli altri complessi e fu chiamato mitosis promoting factor o MPF, è una proteina dimerica, che regola la progressione durante il ciclo e in particolare induce la mitosi. Quindi il MPF, che corrisponde a cdk1 – ciclina B (o A), comincia la sua attività al momento della transizione interfase/profase, cioè all’inizio della fase M, poi raggiunge un massimo in metafase ed infine inizia a diminuire all’inizio dell’anafase.

Nello specifico gli eventi mitotici su cui MPF agisce sono la distruzione della lamina nucleare (che è un reticolo di lamine A, B e C che sostengono la membrana nucleare interna), difatti la fosforilazione in serina da parte di MPF delle 3 lamine nucleari A, B e C causa la depolimerizzazione dei filamenti intermedi e la disintegrazione della lamina nucleare. Quindi la membrana nucleare interna perde il suo sostegno e di conseguenza l’involucro nucleare si scompagina in vescicole, che poi si riformeranno alla fine della mitosi. Il complesso MPF attiva anche la fosforilazione dell’istone H1, che fa parte di quelle proteine di assemblaggio della cromatina, difatti si associa al DNA linker tra un cromosoma e l’altro. In particolare si è osservato che la fosforilazione dell’istone H1 ad opera di MPF contribuisce alla condensazione cromosomica (condensazione del cromosoma), che è un evento importantissimo che deve avvenire in mitosi. Viene attivata anche la formazione della catena leggera della miosina: questo fa parte del meccanismo di citocinesi, di cui si parlerà alla fine della telofase. Infine viene attivata la fosforilazione delle proteine associate ai microtubuli, all’apparato di Golgi e al reticolo endoplasmatico. In particolare la fosforilazione di queste proteine da parte di MPF favorisce la formazione del fuso mitotico e viceversa lo scompaginamento del sistema membranoso citoplasmatico, e questo perché in mitosi il traffico vescicolare, che avviene attraverso il sistema membranoso intracitoplasmatico, cessa. Quindi le proteine associate ai microtubuli vengono fosforilate e questo causa uno smembramento del citoscheletro in interfase e la formazione della struttura citoscheletrica fondamentale della mitosi, che è il fuso mitotico.

Quindi poiché tutti questi eventi sono causati dalla fosforilazione di questi substrati ad opera del MPF, la formazione del MPF dà origine agli eventi mitotici. Ad un certo punto, però, la mitosi deve finire, di conseguenza alla fine della metafase l’MPF stesso induce la propria inattivazione, facendo così revertire tutte le fosforilazioni mitotiche e i relativi eventi. In particolare accade che l’MPF induce la degradazione delle cicline A e B, che vengono inattivate attraverso un SISTEMA DI POLIUBIQUITINAZIONE, cioè attraverso un sistema che agisce nella cellula marcando con delle molecole di ubiquitina le molecole (in questo caso cicline A e cicline B) che devono essere degradate. Poi dopo la marcatura con ubiquitina, le cicline entrano all’interno di un complesso proteosomale multiproteico, in cui ci sono le proteasi che le degradano in quanto marcate. Questo è quindi il primo evento che porta alla reversione dei fenomeni di fosforilazione mitotica e quindi alla fine della fase M. Ma come fa MPF dal punto di vista molecolare a inibire la propria attività, cioè a degradare la ciclina B, che rappresenta la sua subunità attiva?

In particolare si è osservato che, alla fine della metafase, l’MPF attiva un complesso che è chiamato APC (anafase promoting complex), ovvero un complesso che promuove l’anafase e fa terminare la mitosi, inducendo così il passaggio tra metafase e anafase. Difatti il complesso APC attivato, che viene fosforilato dal MPF stesso, che lo attiva, è uno di quegli enzimi che causano la ubiquitinazione della ciclina. Perciò, attivando l’APC, l’MPF attiva l’ubiquitinazione della ciclina e quindi la sua degradazione. Di conseguenza in tarda anafase non si possono più formare i complessi MPF, e questo perché le cicline A e B sono state poliubiquitinate e quindi degradate. Si arriva così alla telofase, in cui la ciclina B è presente a bassissime quantità e l’MPF ha praticamente perso la sua attività.

Ci sono poi dei PUNTI DI CONTROLLO del ciclo cellulare che impediscono ad una cellula, che non abbia ancora completato correttamente una fase, di procedere nella fase successiva. Nello specifico i punti di controllo sono uno a livello della fase S, difatti alla livello di questa fase c’è un punto di controllo che impedisce alla cellula di entrare in fase M, se il suo DNA non è completamente replicato, e questo perché se una cellula con DNA parzialmente replicato entrasse in fase M e si dividesse, si verificherebbe la separazione del materiale genetico nelle due cellule figlie in modo ineguale, e questo è chiaramente un evento che non deve accadere. Esiste un punto di controllo a livello della fase M, difatti quando il fuso mitotico non si assembla correttamente la cellula rimane bloccata in M e non può dividersi, e questo perché anche un assemblaggio erroneo del fuso mitotico porterebbe ad una segregazione non corretta sia del materiale genetico, che del materiale citoplasmatico della cellula madre nelle due cellule figlie, inoltre esistono due checkpoints, a livello delle fasi G1 e G2, causati dal danno al DNA, il che significa che se durante il ciclo cellulare la cellula subisce un danno al DNA, che può essere causato per esempio da radiazioni ionizzanti, intervengono dei meccanismi di controllo mediati da geni che sono chiamati guardiani del genoma, che hanno come funzione quella di mantenere l’integrità genomica, e quindi di proteggere la cellula da mutazioni. Quindi questi geni intervengono e fermano la cellula o in G1 o in G2 allo scopo di permettere ai sistemi di riparo del DNA di ripararlo prima di arrivare in fase M. In particolare il capostipite di queste proteine, che funzionano da guardiani del genoma, è il P53, che agisce direttamente sul DNA.

La proteina P53, chiamata così per il suo peso molecolare che è di 53 kilodalton, è un fattore trascrizionale, che ha un dominio di legame per il DNA. In particolare la P53 è una proteina che agisce in forma di tetramero scorrendo sulla doppia elica di DNA e funzionando da rilevatore di mutazione. Difatti quando la proteina p53 rileva una mutazione, essa viene stabilizzata, e va ad indurre una proteina che si chiama p21-CIP che, associandosi ai complessi cdk-cicline, va ad inibire la cellula in modo stechiometrico. In questo modo la cellula, bloccata in G1 o G2, ha il tempo di riparare il proprio DNA. Quando però la cellula ha un danno al DNA troppo grande per essere riparato, P53 stessa va ad indurre dei geni proapoptotici che portano la cellula alla morte per apoptosi e quindi all’eliminazione e questo perché una cellula con un DNA danneggiato in modo irreparabile deve essere eliminata.

Ci sono poi anche altri fattori, che si comportano in modo simile alla proteina p53, come ad esempio la proteina TGF β (transforming growth factor beta), che ha un’attività antiproliferativa, cioè inibisce la proliferazione. In particolare la proteina TGF β, stimolando la cellula, induce l’espressione di un’altra proteina che si chiama P27, che è un altro inibitore dell’assemblaggio del complesso cdk – cicline (come P21). Difatti la proteina P27, associandosi ad essi, blocca la cellula nel ciclo cellulare e quindi blocca la proliferazione. Inoltre TGF β induce una serie di proteine ad attività antiproliferativa, che sono la P16, la P15, la P18 e la P19, e che sono anch’essi degli inibitori dei complessi cdk – cicline. In generale questi inibitori dell’assemblaggio dei complesso cdk – cicline si chiamano CDKI (cdk inibitors) quindi abbiamo, in tutto, P21, P27, P15, P16, P18 e P19).

Infine bisogna osservare che i principali meccanismi che attivano il controllo del ciclo cellulare nelle cellule normali si esercitano nella fase G1, ad opera di fattori esterni e fattori di crescita, che inducono l’espressione delle cicline della G1 (in particolare delle cicline D) prima del punto di restrizione, dopo il quale la cellula è destinata a progredire lungo la via che porta alla divisione cellulare. Possiamo quindi dire che l’ambiente tissutale ad opera dei fattori di crescita esercita un controllo importantissimo sulla proliferazione cellulare. In particolare questi fattori di crescita promuovono la proliferazione cellulare, e quindi attivano, tramite l’attivazione della trascrizione dei geni di risposta come MIC e la ciclina B, la formazione dei complessi cdk – cicline e quindi reclutano le cellule da G0 a G1. Pertanto senza i fattori di crescita le cellule non potrebbero fare la transizione G0/G1, ma resterebbero sempre in quiescenza e non potrebbero proliferare. Invece nelle trasformazioni tumorali la proliferazione cellulare avviene con un controllo ininfluente, cioè la cellula prolifera senza che il tessuto necessiti di quel tipo cellulare.