Fasi del ciclo cellulare

La citometria a flusso monoparametrica si basa sul principio del funzionamento del contatore cellulare, che funziona attraverso l’inserzione di cellule passanti per un tubino capillare, dove allineate passano una alla volta e attraverso un raggio laser posso contare le cellule passanti a questo livello, inoltre se rendo queste cellule fluorescenti il raggio laser è in grado anche di contare l’intensità di fluorescenza, che può essere di diversa colorazione e questo ci permette di ottenere le percentuali delle cellule divise nelle fasi del ciclo cellulare secondo il contenuto di DNA, che è diploide in fase G0 e G1, nella fase S il DNA ha una quantità variabile tra la condizione diploide e tetraploide, mentre la condizione tetraploide è caratteristica delle fasi G2 e M, in questo caso però si parla di contenuto relativo di DNA, perchè non si basa sulla quantità esatta di DNA presente in ogni cellula, ma valuto solo una sua maggiore o minore presenza tra le diverse cellule. Per fare questo devo usare una sostanza fluorescente che si leghi al DNA in modo quantitativo, un sale di iodio chiamato agente intercalante che noi identifichiamo come il propidio di ioduro che emette una fluorescenza arancione quando viene colpito dai raggi laser. Se vado a costruire il grafico dove abbiamo in ascissa il contenuto del DNA e sulle ordinate abbiamo il numero di cellule, e se andiamo ad interpretare il risultato vediamo come ci sia un primo picco molto alto, che è contraddistinto dalla quantità di DNA delle cellule diploidi presenti in fase G0 e in fase G1, poi abbiamo una zona piuttosto piatta che corrisponde alla zona d’intermezzo delle cellule che hanno una quantità di DNA tra la condizione diploide e la condizione tetraploide, presenti nella fase S, mentre abbiamo anche un secondo picco più basso del primo che rappresenta le cellule tetraploidi presenti in fase G2 e in fase M. La percentuale delle cellule presenti nelle varie fasi la posso calcolare a questo livello attraverso l’area delimitata dal grafico, ma non potendo delimitare bene le aree dei primi due triangoli, ho il problema che posso sottostimare l’area intermedia della fase S, calcolando un’area di minori dimensioni rispetto a quella che dovrebbe realmente rappresentare.

Per risolvere questo problema possiamo operare la CITOMETRIA A FLUSSO BIPARAMETRICA, perchè oltre ad utilizzare il propidio di ioduro utilizzo anche un altro composto per analizzare la fase S, chiamato bromo desossiuridina, una sostanza che non è assolutamente un composto naturale, ma entrando a far parte del processo di duplicazione del DNA mi permette di arrestare questo processo e di vedere così le cellule che sono presenti nella fase S, attraverso un processo piuttosto complicato che mi permette di costruire artificialmente e inserire questa molecola nelle cellule che mi interessa studiare. Per riconoscere questa molecola però ho bisogno di effettuare una reazione anticorpale, nel senso che mi costruisco un anticorpo anti-BrdU che una volta legata la molecola bersaglio emette una fluorescenza verde. Se vado ad analizzare il grafico ottenuto a questo livello, con sulle ascisse la quantità di DNA legata al propidio di ioduro e sulle ordinate la quantità di bromo deossiuridina legata al DNA, che aumentano rispettivamente verso destra e verso l’alto, vedo come dalla finestra R2 (presente in basso a sinistra) alla finestra R3 (presente in basso a destra) aumenta la quantità di DNA, quindi è chiaro che R2 corrisponde alle cellule in fase G0/G1 e R3 corrisponde alle cellule in fase G2/M. Quando dalla fluorescenza solo arancione comincio a vedere anche quella verde, vuol dire che sono già in fase S e posso mettere una linea di demarcazione a questo livello. Come si vede dal grafico, se nella citometria monoparametrica alcune cellule le mettevo in G1 ed altre nelle fasi G2-M, sottostimando S, qui non si sbaglia più e ho una percentuale molto precisa delle cellule in fase S, ed anche nelle altre fasi. Questo è utile se voglio fare un’analisi un po’ più approfondita della distribuzione delle cellule nelle varie fasi del ciclo. Sullo stesso principio si basa il SEPARATORE CELLULARE, detto anche “cell sorter”, perché fa il “sorting” delle cellule, ovvero le separa. Facendo l’esempio più semplice, vediamo che posso utilizzare questa tecnica quando ho una popolazione di linfociti e devo distinguere i CD4+ dai CD8+, quindi i linfociti T helper dai linfociti T soppressori. Posso usare due anticorpi con due fluorocromi diversi, uno rosso per il CD4+ e uno verde per il CD8+. Lo strumento li determina e mette tutto ciò che è rosso da una parte e tutto ciò che è verde dall’altra. Questa metodica è stata molto importante per lo studio delle sottopopolazioni e la vedremo largamente usare in ambiti di ricerca, solitamente però questo strumento deve avere almeno 2 o 3 laser, perché le lunghezze d’onda delle varie fluorescenze sono diverse le une dalle altre, quindi è uno strumento abbastanza costoso e anche complicato da usare, in quanto posso avere diversi marcatori di superficie da separare, utilizzando anche fino a 16 fluorescenze. Addirittura all’inizio degli anni 80, quando in Italia non c’era nemmeno un cell-sorter attivo, in Scozia attraverso questi apparecchi si riusciva già a separare i cromosomi, che a quel tempo rappresentava una scoperta fenomenale, in quanto ha permesso di studiare il DNA dei cromosomi singoli e di effettuare delle vere e proprie genoteche (collezione e catalogazione dei geni di ogni singolo cromosoma) di questi cromosomi. Il metodo alternativo al separatore cellulare è dato dalle BIGLIE IMMUNOMAGNETICHE, che attaccate agli anticorpi anti-CD4+ e anti-CD8+, vengono dopo il loro legame su questi recettori separate attraverso un campo magnetico. Questa è una tecnica che vedremo usare spesso nei laboratori per lo studio delle sottopopolazioni cellulari, ad esempio se all’interno di linfomi si deve separare la popolazione neoplastica, avendo già il marcatore conosciuto, si possono usare queste biglie immunomagnetiche.

Possiamo così trarre delle conclusioni sulle varie fasi del CICLO CELLULARE: le cellule al di fuori del ciclo cellulare sono in fase G0, in particolare ricevono stimoli di sopravvivenza che gli permettono in questo stato di avere una vita più lunga delle altre cellule che vanno poi incontro al completamento del ciclo cellulare, hanno un ridotto metabolismo energetico e sono definite anche come cellule dormienti. In realtà esse devono ricevere dei particolari stimoli per entrare nell’attività proliferativa, e quindi parleremo di un’importante transizione G0-G1, che rappresenta per l’appunto una fase a controllo esterna alla cellula stessa, che agisce attraverso un controllo paracrino. Una volta che la cellula è entrata in fase G1 (che possiamo suddividere in una fase precoce, una fase media ed una fase tardiva), dopo poche ore si iniziano ad attivare i metabolismi macromolecolari, che permettono alla cellula di trascrivere tutti i vari RNA, le varie proteine, abbiamo un’imponente sintesi proteica che ci serve per produrre subunità ribosomali, e questo porta anche ad un aumento delle dimensioni cellulari che arrivano quasi a raddoppiare il loro contenuto proteico. In particolare i geni housekeeping sono tutti costitutivamente trascritti a questo livello, perchè serviranno poi alla cellula per entrare in mitosi, ma vengono anche trascritti geni di regolazione che regolano la progressione della cellula nella fase G1, e sono detti geni ciclo-relati. A questo punto è presente il punto di restrizione o punto di non ritorno, a controllo endogeno, che rappresenta il primo checkpoint di controllo genetico del ciclo cellulare, e viene chiamato anche transizione G1-S. A questo livello agiscono controlli genetici positivi e negativi, e come per tutti i processi a livello cellulare quello che accade dopo è dato dagli stimoli che in questo momento prevalgono da un punto di vista quantitativo, si crea una “competition” in cui gli effetti prevalenti determinano il destino cellulare. Se la cellula viene bloccata a questo livello di checkpoint, ci sono comunque delle alternative, infatti la cellula può attivare il programma genetico (si parla in questo caso di moduli genetici) di apoptosi, può attivare il programma di differenziamento cellulare (che possiamo vedere in ogni caso come l’anticamera del processo di morte cellulare o apoptosi), oppure può tornare in fase di quiescenza attraverso una progressione inversa che la riporta in fase di G0, anche se questo fenomeno è più che altro dato dalla mancanza di stimoli positivi che porterebbero la cellula in fase di mitosi. Se invece gli stimoli positivi prevalgono, si passa nella fase S dove andiamo a duplicare il DNA, anche se questa è una fase piuttosto complicata (vedremo in dettaglio i processi nel modulo di biologia molecolare) perchè la caratteristica intrinseca dei sistemi che lavorano a questo livello di generare errori a livello della catena di DNA, che verrano poi eventualmente trasmessi alle cellule figlie, sono continuamente controbilanciati dall’esistenza di sistemi di riparo del DNA. Finita la fase S, la cellula può entrare in fase G2, ovvero quella fase di preparazione alla mitosi, dove vengono prodotte nuove proteine, quelle che mi permetterano poi di perfezionare la fase mitotica. È comunque un processo abbastanza breve che prosegue con il secondo checkpoint di controllo genetico della proliferazione cellulare, che se arresta la cellula e non gli permette di proseguire in mitosi, essa può andare incontro solo al fenomeno di apoptosi, perchè ha già duplicato il suo DNA e si trova in uno stato tetraploide (questo comunque si può verificare anche in fase S se avvengono degli errori grossolani nel processo di duplicazione del DNA). La fase di mitosi avviene poi in seguito con tutti i suoi processi, poi alla fine segue la citodieresi, ovvero quel fenomeno che riguarda la formazione di un anello contrattile di actina e miosina che strozza la cellula e mi permette di ottenere due cellule figlie che possono poi ricominciare da capo il loro ciclo cellulare.