Differenziamento dei linfociti B

Se vogliamo entrare più nel dettaglio e studiare il differenziamento dei linfociti B, dobbiamo prendere in considerazione l’intera filiera del differenziamento dei linfociti B, che è rappresentata dalla cellula staminale, dal progenitore linfoide, dalle varie forme cellulari che separano il progenitore linfoide dal linfocita B maturo (il linfocita pro-B, il linfocita pre-B e il linfocita B immaturo) e dalla plasmacellula, la quale è una cellula specializzata nella produzione di immunoglobuline, cioè di anticorpi. Rientrano anche qui delle importanti citochine, in particolare le più importanti per la B linfopoiesi sono l’interleuchina 7, che interviene a tutti i livelli di questo processo di differenziamento, l’interleuchina 6, che interviene nel passaggio dal linfocita alla plasmacellula, facendo proliferare i plasmoblasti, poi abbiamo lo “Stem Cell Factor”, che nelle prime fasi di questo differenziamento è assolutamente fondamentale, ed il suo recettore si chiama c-KIT, che è un proto-oncogene, poi abbiamo anche l’interleuchina 3 e l’interleuchina 5, quindi ci sono diversi stimoli citochinici che regolano il processo di differenziamento dei linfociti B.

Dobbiamo distinguere il programma genetico che porta al differenziamento dei linfociti B in due fasi, ovvero una fase midollare, dove abbiamo la cellula staminale e tutte le cellule della filiera differenziativa dei linfociti B, che avviene nel midollo osseo, da cui si produce una popolazione di B linfociti matura, che va nel sangue periferico, diretta negli organi linfoidi secondari. È solo negli organi linfoidi e nel sangue periferico che comincia la fase antigene-dipendente o fase periferica. Questo è un concetto molto importante, perché vuol dire che il nostro repertorio di immunoglobuline che produciamo si forma in automatico, senza che ci sia bisogno del riconoscimento dell’antigene. Quello che fa il midollo osseo infatti è di produrre un’enorme variabilità di linfociti, ognuno dei quali andrà incontro ad un riarrangiamento specifico, quindi risponderà ad un determinato antigene, ma tutti quanti i linfociti B si formano con lo stesso repertorio comune senza bisogno dello stimolo antigenico. Lo stimolo antigenico è quello che perifericamente (nella fase periferica) selezionerà il clone, un linfocita B specifico, che è in grado di interagire con uno specifico antigene. Nella fase periferica avremo quindi il differenziamento finale del linfocita B in plasmacellula, cioè in quel tipo di cellule che hanno espanso talmente tanto il reticolo endoplasmatico rugoso, l’apparato del Golgi e più in generale l’apparato secretorio, che sono specializzate solo nella produzione e nella secrezione di immunoglobuline specifiche.

Ci sono delle neoplasie, che si chiamano plasmocitomi, che sono neoplasie delle plasmacellule, mentre a monte i linfociti B danno delle neoplasie che si chiamano linfomi. Le plasmacellule del plasmocitoma, prendono il sopravvento come popolazione cellulare tumorale e producono quantità industriali di immunoglobuline, che sono monoclonali, cioè tutte uguali, infatti la neoplasia opera una selezione clonale, cioè il clone neoplastico si sviluppa per clonazione, quindi le plasmacellule prodotte, producono lo stesso tipo di immunoglobuline.

Se andiamo ad analizzare la STRUTTURA DELLE IMMUNOGLOBULINE, vediamo come queste proteine siano state purificate per la prima volta nel sangue periferico perchè erano presenti in elevate concentrazioni, attraverso analisi specifiche (ad esempio attraverso il protidogramma elettroforetico, ovvero un’elettroforesi svolta sulle proteine presenti nel siero), dove abbiamo le α-globuline, le β-globuline, le γ-globuline e l’albumina, in particolare vediamo che il picco delle γ-globuline, ovvero le vere e proprie immunoglobuline, è enorme. Purificando queste proteine ci si è resi conto di come erano strutturate, ovvero si parla di due catene pesanti e di due catene leggere, unite da ponti disolfuro, sia le catene pesanti tra di loro, che le catene pesanti con le catene leggere, sia anche le catene leggere tra di loro. È partito poi lo studio strutturale di queste proteine che ci dice che abbiamo un frammento FC, che è una parte della catena pesante costante per ogni tipo di immunoglobulina (esistono delle porzioni costanti anche a livello della porzione C-terminale delle immunoglobuline), poi abbiamo sulla parte N-terminale della catena pesante e della catena leggera, delle regioni che variano per ogni tipo di immunoglobulina. Questa regione cambiava drasticamente da un’immunoglobulina ad un’altra, inoltre dobbiamo tener presente che fino a quel momento, e siamo negli anni ‘60-’70, si diceva “un gene corrisponde ad una proteina”, oppure che un gene corrisponde a qualche variante di una proteina, ma questo lo si diceva solo dopo che è stato scoperto lo splicing alternativo. Facendo un minimo di conti su questa regione ipervariabile si era visto che in realtà, più del 50 % dei geni presenti sul genoma umano avrebbero dovuto codificare per queste proteine, e questo era impossibile, da qui infatti è stato messo in dubbio il dogma “un gene corrisponde ad una proteina”, e la definizione della formazione di queste immunoglobuline è partita dagli studi sulle sue stesse proteine.

Ma come sono disposti i geni delle immunoglobuline? Limitandosi ai locus genici umani vediamo che le catene pesanti sono codificate dai geni presenti sul cromosoma 14, le catene leggere sono invece di due tipi, le λ e le K, con le catene leggere K che hanno i loro geni presenti sul cromosoma 2, mentre sul cromosoma 22 abbiamo i geni che codificano per le catene leggere λ. Quindi abbiamo tre cromosomi su cui sono presenti i loci che codificano per le immunoglobuline, ma come sono strutturati sul DNA questi geni? Partiamo sempre nel verso 5’-3’, in questo caso iniziamo ad analizzare le sequenze sul cromosoma 14 e notiamo delle “box” che si susseguono, ed esse non sono altro che geni, ed essendo geni contengono sia esoni che introni. Abbiamo circa un migliaio di geni che chiamiamo V, che significa “Variability”, sono i geni VH (H sta per pesante, è riferito alla catena pesante delle immunoglobuline), che vengono poi numerati in progressione come VH1, VH2, VH3 fino ad arrivare a numeri sempre più grandi, mentre a monte di ogni gene VH, c’è un piccolo gene sempre in tandem, cioè associato, che codifica per la sequenza leader. Questi mille geni VH si sono formati per endoduplicazione dei geni VH e dei geni L (geni che codificano per la sequenza leader del peptide segnale), che si sono endoduplicati in modo associato, poi come succede sempre nel corso dell’evoluzione, questi mille geni sono andati incontro a delle divergenze, tant’è vero che sono riunibili in otto famiglie. Dopo questa serie di geni, più a valle abbiamo i geni DH, che sono circa un centinaio, in particolare la D sta per “Diversity”, ma nonostante ce ne siano un numero cosi grande, molti possono essere pseudogeni, cioè possono aver perso la loro funzione e non codificare più a causa di modificazioni strutturali subite. Dopo questo insieme di geni abbiamo ancora più a valle i geni J (J sta per “Joining”, ovvero per articolazione), cioè i geni che Tonegawa ha riconosciuto con la sonda molecolare, questi geni sono circa una decina e comprendono due pseudogeni, quindi abbiamo JH1, JH2, JH3, per poi arrivare fino a JH10. Questi (ovvero i geni VH, i geni LH, i geni DH e i geni JH) sono tutti i geni che codificano per la regione ipervariabile, poi abbiamo la regione costante, caratterizzata da una serie di geni diversi a seconda della catena pesante che stiamo andando a caratterizzare, ed in ordine abbiamo il gene μ, che appartengono alle IgM, il gene δ che appartengono alle IgD, i geni γ3, γ1, γ2 e γ4 che sono presenti in ordine sparso ed appartengono alle IgG, poi abbiamo i geni ε2 e ε1 che appartengono alle IgE ed infine abbiamo i geni α1 e α2 che appartengono alle IgA. Le porzioni costanti sono tutte rivolte verso il 3’ e la loro diversità è data dalle diversità delle immunoglobuline esistenti. A valle di tutte queste porzioni costanti che si chiamano CH (questa sigla indica la porzione costante della catena pesante), abbiamo un tratto transmembrana TM e un tratto citoplasmatico, il che ci dice già che questa catena pesante si incastrerà nella membrana del reticolo endoplasmatico rugoso, come se fosse un recettore. Molto più semplice è invece il locus delle catene leggere K, abbiamo infatti una serie di circa 1000 geni definiti come geni VK, che identificano le catene variabili K, sempre caratterizzate a monte dai geni L che codificano per la sequenza leader, infatti anche questi geni si sono endoduplicati in tandem, ma nel locus delle catene leggere K mancano i geni della diversità, ci sono invece i geni di articolazione, che sono i geni JK, anche qui circa in una decina, mentre abbiamo poi una sola porzione costante CK. Se invece andiamo a vedere sul cromosoma 22 le catene leggere λ, vediamo che hanno una disposizione speciale, perché è vero che c’è una serie di geni Vλ, circa un migliaio, preceduti sempre dai geni L che codificano per la sequenza leader, però dobbiamo osservare che l’endoduplicazione ha fatto si che si siano endoduplicati anche i geni di articolazione J, con la porzione costante, quindi si formano delle sequenze in successione date da Jλ1C1, Jλ2C2, e così via, questo perché i meccanismi di endoduplicazione hanno preso in considerazione dei tratti più o meno grandi di DNA, ovvero uno o più geni che sono andati incontro a questo particolare processo.

Il differenziamento dei linfociti B è paradigmatico (ovvero un modello) per quanto riguarda l’espressione genica, in quanto avvengono tutti i meccanismi che regolano questo processo: per le catene pesanti, realizzati i due riarrangiamenti, si forma un lungo trascritto primario di mRNA, cui seguono meccanismi di splicing alternativo che nella fase iniziale, per quanto riguarda le porzioni costanti, tengono in considerazione solamente le sequenze Cμ e Cδ. Si ha dunque un trascritto maturo composto dalla sequenza leader L, dalla sequenza VDJ, da uno dei tratti Cμ o Cδ, dal tratto transmembrana e dal tratto citosolico. All’inizio dunque solamente due tipologie di immunoglobuline sono prodotte, ovvero le IgM monomeriche di membrana con il tratto costante Cμ, e le IgD monomeriche di membrana con il tratto costante Cδ. Un fenomeno analogo avviene anche sulle catene leggere, anche se qui mancano le sequenze D della diversità, nelle catene leggere K vi è una sola porzione costante (a differenza dei locus genici λ) e non ci sono le sequenze transmembrana e citoplasmatiche, dunque il riarrangiamento è produttivo quando avviene solamente la giustapposizione del gene V con il gene J.

Dallo studio delle cellule e delle immunoglobuline monoclonali di cellule di plasmocitoma, ci si rese conto che sarebbero stati necessari miliardi di geni per codificare la regione ipervariabile, qualora la conformazione di una singola tipologia d’immuonglobulina fosse stata attribuibile ad un singolo gene, la VARIABILITÀ si genera invece attraverso incastri probabilistici (solamente nella fase midollare, ovvero nella fae antigene-indipendente) ed è ottenuta utilizzando una porzione relativamente ridotta di DNA. Le possibilità di combinazione dei geni delle catene pesanti e delle catene leggere porta ad un repertorio di linfociti che ha una variabilità che è di 109-1011 tipi di linfociti producibili, ciò si traduce in altrettante possibilità di riconoscere altrettanti antigeni. Tale meccanismo lascia supporre che il sistema immunitario abbia memorizzato tutto quello con cui noi, nel corso dell’evoluzione, siamo venuti in contatto, e abbia perfezionato le modalità di interazione con le proteine esogene, la complessità che lo contraddistingue mostra che da un punto di vista evolutivo siamo venuti in contatto con miliardi di proteine antigeniche riconosciute come esogene dall’organismo. Ogni linfocita B appena formato ed entrato nel sangue periferico riconosce un antigene diverso e opera una sorveglianza sull’immunità specifica (che agisce su un determinato stimolo esterno in maniera specifica), ma bisogna sottolineare anche come il sistema sia caratterizzato da una notevole plasticità per cui, anche venendo in contatto con antigeni nuovi, purché proteici, esso è in grado di riconoscerli, di rispondere al loro ingresso e di tenerne memoria.

Il RIARRANGIAMENTO avviene prima su un allele, ma se l’operazione ricombinante non è produttiva si passa allora sull’altro allele e si cerca di riarrangiarlo, esistono infatti situazioni in cui i due alleli sono riarrangiati, uno in modo produttivo, l’altro in maniera non produttiva. Nel caso in cui entrambi gli alleli risultino riarrangiati in modo non produttivo si attiva la via apoptotica. Il meccanismo è gerarchico, si parte infatti a riarrangiare il locus genico delle catene pesanti sul cromosoma 14, con due eventi di ricombinazione, che portano alla formazione del tratto di DNA DJ e poi del tratto VDJ, si passa poi a riarrangiare il locus genico delle catene leggere sul cromosoma 2 prima su di un allele e poi se non ci si riesce, sull’altro allele. Se il riarrangiamento è produttivo si formeranno le catene K, invece se non lo è si passa sul cromosoma 22 dove possono essere prodotte le catene leggere λ, provando a ricombinare prima un allele e poi l’altro. Se non riesce questo meccanismo la cellula va in apoptosi, a meno che non si tratti di una cellula tumorale, infatti esistono patologie delle catene pesanti, nella quale la cellula produce solo delle catene pesanti.

I linfociti B maturi hanno così sulla loro superficie cellulare delle IgM o delle IgD monomeriche che funzionano come recettori e possono incontrare l’antigene. Questi processi avvengono nella fase midollare, antigene-indipendente, e hanno come risultato un patrimonio di linfociti B in grado di fare sorveglianza su 109-1011 antigeni diversi. Il midollo è riccamente vascolarizzato e questi linfociti B maturi passano poi in circolo dove rappresentano il 30-40 % dei linfociti circolanti, essi andranno ora a popolare gli organi linfatici secondari. A questo punto inizia la fase periferica che vede il differenziamento terminale del linfocita B a plasmacellula sotto un particolare stimolo antigenico, per azione in particolare dell’interleuchina-6.