Differenziamento cellulare

Il differenziamento cellulare (non è altro che una specializzazione cellulare o di porzioni cellulari nello svolgere una determinata funzione, ad esempio possiamo dire che le piastrine hanno una funzione legata alla coagulazione del sangue, mentre i globuli rossi per il trasporto dell’ossigeno e i granulociti a seconda del tipo hanno un’immunità che può essere generica o specifica), ed in particolare possiamo dire che la logica della regolazione di tutti i tessuti o dei microambienti passa attraverso l’omeostasi fisiologica, ovvero in particolari distretti corporei, ad esempio nelle cripte intestinali, vediamo che l’epitelio intestinale è un tessuto ad alta capacità proliferativa, infatti si ricambia circa ogni 25 giorni (in caso di chemioterapia a decorso quindicinale, la distruzione di questo epitelio che non fa in tempo a rigenerarsi crea diversi ed importanti disturbi intestinali), questo fatto è garantito da cellule staminali quiescenti situate proprio nel fondo della cripta. Analizzando ancora la struttura, andando verso il lume intestinale, troviamo poi le cellule staminali proliferanti, poi abbiamo ancora più sopra le cellule in differenziamento e infine noteremo cellule in apoptosi che stanno sfaldandosi verso la superficie del lume intestinale. Questo equilibrio tissutale è dato proprio dalla sequenza delle fasi di quiescenza, proliferazione, differenziamento e apoptosi cellulare, alla base della logica di qualunque sistema biologico che si ricambia, un’eventuale alterazione di questo equilibrio crea infatti una patologia, ad esempio si parla di situazioni di aplasia quando si arriva alla mancanza di tessuto, derivata da una ridotta proliferazione cellulare che prende il nome d’ipolasia, abbiamo invece delle situazioni d’iperplasia se c’è una proliferazione esagerata del tessuto, che se accompagnata da ridotte o cospicue alterazioni genetiche prende rispettivamente il nome di displasia o di neoplasia. Questa stessa logica la possiamo vedere nell’epidermide e nel follicolo pilifero, anche se i meccanismi con cui le cellule staminali portano alla ricrescita del follicolo pilifero non sono ancora ben conosciuti, in questo senso alcuni scienziati sono già riusciti a riprodurre in vitro la struttura di un bulbo pilifero, ma se si riuscisse a capire come fare ricrescere i capelli attraverso le cellule staminali si darebbe vita a un business planetario. La stessa logica è presente anche nell’epitelio corneale dove le cellule staminali sono nel “limbus” (quella struttura più esterna che delimita la cornea, che a sua volta va a delimitare centralmente il foro della pupilla), che migrano poi verso il centro dell’occhio e ricoprono, differenziandosi, la superficie oculare (dando luogo ad una caratteristica veramente unica di questo tessuto che è la trasparenza), formando l’epitelio corneale. L’epitelio corneale grazie alla sua trasparenza riesce a ricevere gli stimoli, infatti è trasparente perché è un tessuto privo di vasi sanguigni. Anche nell’epitelio mammario le cellule staminali si trovano profondamente nel terminale delle ghiandole mammarie e poi spostandosi, si differenziano ed iniziano a secernere le sostanze caratteristiche che le contraddistinguono.

Quindi c’è una logica stringente in base alla quale le cellule staminali quiescenti garantiscono il ricambio a questi tessuti: noi sappiamo il vantaggio dell’essere quiescenti, cioè il fatto che queste cellule consumano poca energia poichè ricevono solo stimoli di sopravvivenza e sono poco danneggiate dagli stimoli esterni. Una cellula infatti, viene danneggiata soprattutto quando duplica il proprio DNA, se la cellula invece rimane quiescente il DNA rimane più stabile e compatto ed è difficile che possa essere mutato. Questo ricambio cellulare o “self renewal” sembra legato alla via di WNT e quindi della β-catenina, questi due tipi di molecole però non spiegano tutto il “self renewal”, altrimenti basterebbe mettere insieme WNT e un’elevata concentrazione di ligando per ottenere in vitro sempre un processo di “self renewal”.

Per spiegare il differenziamento possiamo considerare il microambiente emopoietico, il quale è caratterizzato da un insieme di cellule che dialogano tra loro: c’è infatti uno stroma composto dai fibroblasti, dagli adipociti e anche da osteoblasti e osteoclasti che ricambiano il tessuto osseo: tutte queste cellule le possiamo considerare cellule effettrici, cioè cellule che producono i fattori di crescita emopoietici, tranne la trombopoietina e l’eritropoietina che sono prodotte dal rene e che funzionano con un meccanismo endocrino. Poi all’interno di questo tessuto abbiamo tutte le cellule in via di differenziazione del sangue, quindi si va dalla cellula staminale quiescente a quella proliferante, e si arriva a tutti i tipi di cellule in differenziamento che abbiamo diviso generalmente secondo una linea mieloide e una linea linfoide. Se facciamo infatti a questo livello una microscopia elettronica vediamo tanti tipi cellulari con caratteristiche diverse che formano un insieme di cellule eterogeneo: possiamo notare per esempio un promielocita (cellula in fase di differenziamento della linea granulocitaria) eosinofilo che ha una caratteristica granulazione intracitoplasmatica, oppure possiamo vedere dei megacariociti, ovvero cellule polinucleate dalle quali vengono prodotte le piastrine. Per differenziarsi la cellula perde le capacità proliferative: infatti diventa una cellula postmitotica, quindi non più in grado di proliferare, in seguito arriva a differenziarsi terminalmente, ovvero a produrre tutte le proteine che servono per la specializzazione della cellula e poi inevitabilmente con un “timing” differente a seconda del tipo cellulare va incontro al processo di apoptosi: la scelta della linea differenziativa deriva da un meccanismo probabilistico legato ai fattori trascrizionali, ad esempio nell’emopoiesi, ma anche in tutti gli altri sistemi cellulari biologici, ci sono dei “master regulator” che dicono alla cellula cosa deve fare e in quale filiera differenziativa deve rientrare, da una cellula staminale unica infatti, possiamo ottenere tantissime cellule terminali diverse. Questo è un sistema paradigmatico (che serve da modello, da esempio) perché ci permette di studiare come una cellula regolando i propri programmi genetici riesca a dare origine a tantissimi programmi cellulari.

Se andiamo ad analizzare il processo di granulocitopoiesi, in particolare quello dei granulociti neutrofili, abbiamo come precursore un mieloblasto da cui si producono proprio i granulociti maturi. Nel midollo osseo, in circa una settimana, si completa il differenziamento dei granulociti che passano poi nel sangue periferico, dove circolano per recarsi nei distretti tissutali dove c’è bisogno della loro azione. I granulociti neutrofili circolano nel sangue periferico per circa 18 ore, ad un certo momento poi i granulociti hanno un meccanismo che fa parte della motilità caratteristica di queste cellule, per cui passano attraverso le cellule endoteliali prima aderendo ad esse con un fenomeno di “rolling”, poi attraverso il processo di diapedesi riescono a passare attraverso queste cellule endoteliali (con l’internazione di numerosissime strutture recettoriali e di citochine) e a raggiungere il tessuto besaglio sottostante, questo così permette ai granulociti neutrofili di essere distibuiti in tutti i tessuti dell’organismo. Poi dopo un’altra settimana dall’entrata di queste cellule nei tessuti, se queste cellule non sono attivate vanno incontro al processo di apoptosi, quindi fondamentalmente sono ricambiate ogni 15 giorni. Se andiamo ad analizzarne le concentrazioni, vediamo come essi siano circa 4’000 per mm³, e quindi su 4 litri di sangue ci sono tantissimi granulociti neutrofili che devono essere ricambiati. Riferiti invece ai globuli bianchi, un 60 % sono granulociti neutrofili, inoltre andiamo incontro a partire dall’infanzia ad un inversione della formula leucocitaria, infatti nei bambini sono molto di più i linfociti che non i granulociti, questo vuole dire da piccoli siamo sottoposti più a infezioni virali che batteriche (dove i granulociti avrebbero un ruolo più rilevante), infatti a partire dall’adolescenza si modifica questa situazione e in età adulta si otterranno le concentrazioni normali per una classica formula leucocitaria. Quindi il midollo fa un lavoro grandissimo per la formazione dei granulociti neutrofili, così come anche per i globuli rossi, ci troviamo di fronte dunque ad una situazione di tessuto ad alta capacità proliferativa.

Le piastrine derivano dal campeggiamento piastrinico dei megacariociti e abbiamo accennato che quando la cellula staminale emopoietica prende contatto con l’endotelio si forma la nicchia vascolare: il differenziamento della cellula staminale a questo punto è megacariocitario. Il megacariocita prende contatto con la parete vasale e con l’endotelio, poi infila i lembi di citoplasma nei capillari e si comincia ad avere il campeggiamento piastrinico, dove si rompono pezzi di citoplasma funzionali che andranno a circolare nel sangue, ed è questo il motivo per cui ci ritroviamo più di 250’000 piastrine per mm³.

Il globulo rosso invece, all’inizio è presente come eritroblasto, ovvero una cellula normale con il nucleo, all’inizio abbiamo però che i proeritroblasti (forme cellulari maggiormente indifferenziate degli eritroblasti) proliferano altamente attraverso lo stimolo indotto dall’eritropoietina, poi avviene la condensazione cromatinica, sembra che la cellula muoia (la condensazione cromatinica è infatti uno dei meccanismi che vedremo nell’apoptosi) mentre invece la cellula si libera semplicemente del nucleo attraverso un meccanismo di estrusione nucleare, a questo punto il globulo rosso rimane praticamente solo con un altissimo contenuto di emoglobina citoplasmatica, necessaria per il trasporto dell’ossigeno e della CO2 verso i tessuti e verso i polmoni.

Poi in circolo, quando c’è un infezione, abbiamo che le plasmacellule si differenziano in maniera massiccia attraverso la fase terminale differenziativa dei linfociti B, esse diventano così delle cellule con un nucleo piccolo e un ampio citoplasma molto espanso, importante per la “pathway secretoria” a cui va incontro questa cellula, infatti sono cellule specializzate nella secrezione di immunoglobuline di vario tipo.

Ma come si studia il differenziamento cellulare? Esso si studia prendendo delle cellule in vitro, le coltivo nelle mie piastre e le faccio proliferare con i loro specifici fattori di crescita, poi invio delle sostanze che inducono il differenziamento nella mia popolazione cellulare, che sono chiamate generalmente agenti differenzianti. Prendiamo ad esempio un prototipo di studio di cellule HL-60, ovvero cellule ammalate di leucemia acuta mieloblastica, che sono state messe in coltura negli anni ’60, ma vista la longevità delle colture di cellule tumorali, è una linea cellulare che si utilizza ancora oggigiorno, ormai sono dunque quasi 50 anni che queste cellule vengono coltivate ed utilizzate nei laboratori di ricerca. Queste sono cellule leucemiche ferme in un particolare stadio differenziativo, per cui il loro differenziamento cellulare è bloccato, ma in realtà se uso degli agenti differenzianti riesco a far differenziare anche questo tipo di cellule. Ad esempio posso usare l’acido retinoico, un derivato della vitamina A chiamato “All Trans Retinoic Acid” o ATRA, una delle due forme terapeutiche dell’acido retinoico che viene utilizzata per curare questo tipo di leucemia, ovviamente all’interno di queste cellule è presente il recettore RAR-α (Retinoic Acid Receptor α) e la via che si attiva porta ad un differenziamento terminale in granulociti neutrofili. Se uso invece un’altra vitamina, sempre della famiglia degli ormoni steroidei (e quindi che utilizza dei recettori nucleari), come la vitamina D3 (in quanto queste cellule possiedono il recettore VDR), succede che queste cellule si differenziano in monociti. Se uso invece degli esteri del forbolo (indicati con la sigla PMA) le cellule si differenziano in macrofagi. Questo è uno schema molto interessante per capire cosa vuol dire differenziamento cellulare, ma anche in ematologia, per capire come si sviluppano, che caratteristiche hanno e come possono essere curate specifici tipi di leucemie, come quella che caratterizza questo tipo di cellule. Ci sono anche altre linee cellulari che sono un pò più mature di quelle appena viste, come le cellule NB4, anche queste derivate da un paziente e utilizzate in coltura da circa 25 anni, questa è una linea cellulare caratterizzata dall’essere un pò più in avanti in termini di differenziamento cellulare della linea cellulare delle cellule HL-60, in quanto in questo caso ci troviamo di fronte a dei promielociti, a differenza delle cellule HL-60 analizzate precedentemente che sono dei mieloblasti. Se io vado ad usare gli stessi agenti inducenti su queste cellule NB4, vedo che non ottengo una risposta differenziativa con il trattamento con vitamina D3, non ottengo una risposta differenziativa nemmeno con l’utilizzo del PMA, mentre invece trovo una risposta importante con l’utilizzo della molecola ATRA, questo vuol dire che mentre la cellula prosegue nel suo differenziamento, essa risponde sempre a meno stimoli differenziativi, infatti in questo caso la cellula è monolineare e si differenzia solamente nei granulociti neutrofili.