Cosa sono i telomeri?

 

Il DNA telomerico è un DNA ripetitivo cioè risulta dalla continua ripetizione di una certa sequenza che può essere chiamata unità ripetitiva (questa è una definizione che vale comunque per tutti i DNA ripetitivi). In particolare nel protozoo “Tetrahymena” l’unità ripetitiva è data dalla sequenza “CCCCAA”, e per essere più precisi, questa è la sequenza che viene osservata sul filamento che ha il 5’ rivolto verso il telomero e il 3’ rivolto verso il centromero. Convenzionalmente, si dice che questo filamento è quello ricco in CA, mentre il filamento complementare di conseguenza viene denominato come filamento ricco in TG. Le sequenze telomeriche sono poi state isolate in organismi sempre più evoluti, fino ad arrivare all’uomo, e si è visto che più o meno la sequenza dall’unità ripetitiva è sempre molto simile e ha una lunghezza che varia dai 5 ai 10 nucleotidi (nei vari eucarioti), in particolare nell’uomo la sequenza dell’unità ripetitiva è “CCCTAA”, differisce per cui da quella del protozoo in cui è stata scoperta per un solo nucleotide, in particolare per la quarta “C”, che è sostituita da una “T”, da ciò ne deriva che il DNA telomerico è altamente conservato nelle varie specie viventi.

Ma a cosa servono i telomeri? Bisogna subito dire che non servono soltanto a quello a cui si era pensato inizialmente, cioè a stabilizzare le estremità cromosomiche e ad impedirne l’attacco da parte delle esonucleasi, infatti hanno anche delle funzioni più complesse. Possiamo riassumere le funzioni dei telomeri sostanzialmente in due aspetti, ovvero servono a contrastare la tendenza all’accorciamento del DNA che si trova sugli estremi di un cromosoma, infatti se non ci fossero questi telomeri le molecole di DNA in poco tempo perderebbero gran parte del loro materiale genetico. Inoltre contrastano una serie di fenomeni che si verificano a livello delle estremità del DNA, fra cui la degradazione ad opera delle esonucleasi, le estremità libere di DNA tenderebbero ad avviare la ricombinazione all’interno del nucleo di una cellula eucariotica, in quanto sono ricombinogeniche, e questo può eventualmente causare anomalie cromosomiche. La cellula non è infatti in grado di distinguere un’estremità libera di DNA derivante dalla rottura a doppia catena di un cromosoma dalle estremità libere di DNA di un cromosoma integro, perciò i telomeri hanno lo scopo di evitare la ricombinazione a livello delle estremità cromosomiche. Per lo stesso motivo, ossia per il fatto che la cellula non è in grado di distinguere le estremità di un cromosoma da quelle libere derivanti dalla rottura di un cromosoma, in assenza di telomeri potrebbe scatenarsi il fenomeno di riparo del DNA, fra l’altro il riparo del DNA si svolge anche all’interno di quella che è la risposta mediata dalla proteina P53, che tende ad indurre l’apoptosi quando il riparo non avviene correttamente.

Vediamo ora come queste due funzioni vengono assicurate: per quanto riguarda il CONTRASTO DELL’ACCORCIAMENTO DEL DNA A LIVELLO DEI TELOMERI, innanzitutto cerchiamo di capire perché la replicazione del DNA tenderebbe a determinare l’accorciamento dei telomeri, per fare questo dobbiamo fare un passo indietro e tornare a rivedere il processo di replicazione del DNA. Il fenomeno di replicazione del DNA viene avviato a partire dai siti d’origine, che sui cromosomi eucariotici sono numerosi, ovviamente, in ogni cromosoma è possibile individuare i due siti d’origine più vicini alle estremità, ovvero quelli più esterni. Vediamo ora cosa accade a livello di un sito d’origine immediatamente a ridosso di un’estremità di un cromosoma eucariotico. Come già sappiamo, da questo sito si originerà una bolla replicativa, divisa in 2 forcine replicative, ed una forcina procederà in senso telomerico, mentre l’altra in direzione centromerica. Se andiamo ad analizzare la forcina che procede in senso telomerico, vediamo che all’interno della forcina ci sono due stampi, in particolare uno ha il 3’ rivolto verso il centromero e il 5’ rivolto verso il telomero, mentre l’altro ha il 5’ rivolto verso il centromero e il 3’ rivolto verso il telomero. Lo stampo avente l’estremità 3’ rivolta verso il centromero e l’estremità 5’ rivolta verso il telomero, verrà replicato con la modalità del “filamento leading”, infatti su questo stampo sarà richiesta la sintesi di un unico innesco e a quel punto la sintesi del DNA procederà in modo continuo. Quando la denaturazione sarà terminata all’estremità telomerica, il filamento neosintetizzato arriverà ad allinearsi con l’estremità del filamento stampo, perciò, qui non succede niente di particolare. L’altro filamento stampo dovrà essere replicato con la modalità del “filamento lagging”, perché su di esso la sintesi dovrà procedere in direzione opposta rispetto alla direzione di spostamento della forcina, verranno perciò prodotti tanti frammenti di Okazaki, la sintesi di ognuno dei quali sarà preceduta dalla sintesi di un relativo innesco, in generale sappiamo comunque che la sintesi di questo filamento di DNA procederà in modo frammentario e saranno richiesti inneschi multipli. A mano a mano che questa forcina replicativa procede verso l’estremità telomerica, su questo filamento di DNA si può verificare un particolare problema, infatti egli deve dirigere la sintesi del DNA dal telomero verso il centromero, in direzione opposta rispetto all’apertura della forcina di replicazione, tutto procederà come già abbiamo visto accadere sui “filamenti lagging” classici nella replicazione del DNA, fino a che non si arriverà all’estremità 3’ dello stampo. A questo punto potranno verificarsi due situazioni, infatti come sappiamo, negli eucarioti i frammenti di Okazaki hanno una lunghezza fissa di 200 nucleotidi, e questo perché l’innesco successivo viene sempre posizionato 200 nucleotidi a valle sul filamento stampo, rispetto all’inizio del frammento di Okazaki che lo precede. Non sappiamo perché questo avvenga, probabilmente perché all’interno del complesso proteico in cui funziona e svolge il suo lavoro la DNA polimerasi α, responsabile della sintesi dell’innesco, per ragioni steriche essa viene a trovarsi proprio a contatto con quel punto dello stampo. Se lo spazio rimasto disponibile sullo stampo ha una lunghezza inferiore ai 200 nucleotidi, non può essere prodotto l’ultimo innesco, perché, come appena sottolineato, esso deve essere posizionato 200 nucleotidi a valle, perciò, l’ultimo frammento di Okazaki non può essere sintetizzato. Di conseguenza, l’ultimo tratto del filamento stampo avente l’estremità 3′ a livello del telomero non potrà essere duplicato nel corrispondente filamento neosintetizzato. Invece, se lo spazio che rimane libero sul filamento stampo è di esattamente 200 nucleotidi, l’ultimo innesco può essere sintetizzato e a partire da esso viene sintetizzato l’ultimo frammento di Okazaki, poi l’innesco verrà rimosso attraverso i meccanismi che abbiamo già visto, che sappiamo essere mediati dall’enzima FEN1. Si produrrà così lo stesso fenomeno visto in precedenza, infatti una volta rimosso l’innesco, l’ultimo tratto dello stampo avente l’estremità 3′ a livello del telomero, non potrà essere replicato nel corrispondente filamento neosintetizzato, in quanto non sarà possibile sintetizzare un ulteriore innesco da 200 nucleotidi a monte. Per poter riempire il gap, le DNA polimerasi dovrebbero sintetizzare in direzione opposta rispetto a quanto fanno normalmente, ossia dal 3’ al 5’, ma questo è impossibile. Ciò che varia nelle due situazioni è la lunghezza del segmento di DNA che non viene replicato, infatti in questo caso sarà di 40 nucleotidi (esattamente la lunghezza dell’innesco eucariotico), nel caso precedente sarà invece sicuramente inferiore a 200 nucleotidi. Questo fenomeno ha determinato un accorciamento della catena del DNA, ma solo a livello di uno dei due filamenti, in quanto il filamento stampo è rimasto integro, inoltre dobbiamo tenere in considerazione che stiamo analizzando quanto avviene a livello di una estremità di una delle due molecole figlie, ma la stessa cosa si verificherà anche sull’altra molecola figlia di DNA, anche se sull’estremità opposta, questo fenomeno infatti si verifica a livello di tutti gli stampi che terminano con l’estremità 3′ al telomero.

Al successivo ciclo di replicazione del DNA, ciascuno dei due filamenti di DNA di quella che attualmente è una molecola figlia farà da stampo per un nuovo ciclo di replicazione del DNA, a quel punto il filamento neosintetizzato più breve della precedente replicazione, farà da stampo per il nuovo filamento di DNA e l’accorciamento della molecola di DNA diventerà completo.

Se i telomeri venissero perciò replicati secondo il meccanismo convenzionale di replicazione del DNA, che abbiamo visto fino ad ora, andrebbero incontro ad un rapido accorciamento. Questo problema è stato risolto attraverso un meccanismo di replicazione indipendente da quello convenzionale, che ha preso piede nel corso dell’evoluzione, che è mediato dall’enzima TELOMERASI. Intanto diciamo subito che le estremità dei cromosomi eucariotici non sono piatte, infatti, tutti i telomeri hanno alle loro estremità il filamento 3′ che sporge rispetto al filamento avente l’estremità 5′, quindi i 2 filamenti appaiono spaiati l’uno rispetto all’altro, perciò le estremità dei telomeri sono sempre del tipo 3′ protrusive. Abbiamo visto che il filamento avente l’estremità 3′ a livello dell’estremità telomerica è quello ricco in GT, mentre quello avente l’estremità 5′ a livello dell’estremità telomerica è ricco in CA. La telomerasi è una ribonucleoproteina, ovvero è un enzima di natura ribonucleoproteica, in particolare la componente ribonucleica all’interno della telomerasi è rappresentata da una molecola di RNA a singola catena lunga 150 nucleotidi nel protozoo in cui è stata scoperta, e circa 400/450 nucleotidi nell’uomo. La componente proteica invece è rappresentata dall’enzima trascrittasi inversa o retrotrascrittasi, normalmente presente in natura a livello di particolari virus chiamati retrovirus, che si caratterizza per compiere un azione esattamente opposta alla trascrizione nel DNA, infatti sappiamo che la trascrizione consiste nel sintetizzare un filamento di RNA a partire da uno stampo di DNA, mentre la trascrizione inversa invece consiste nel sintetizzare un filamento di DNA utilizzando uno stampo di RNA, in altri termini, la trascrittasi inversa è una DNA polimerasi RNA-dipendente. Nei retrovirus è importante perchè serve a trascrivere il loro genoma, fatto di RNA, in DNA che verrà poi integrato nel genoma delle cellule ospiti. Ritroviamo la trascrittasi inversa anche nelle cellule umane perché nel corso dell’evoluzione queste cellule sono state letteralmente bombardate da infezioni retrovirali, nel genoma umano ci sono circa 20.000 retrovirus mutati, integratisi nel corso dell’evoluzione nel nostro genoma, e rappresentano la memoria di quanto avvenuto nel corso dell’evoluzione molecolare degli eucarioti. La molecola di RNA della telomerasi contiene al suo interno due unità ripetitive, ed esse sono sequenze ricche in CA, invece, come abbiamo appena visto, il tratto sporgente del filamento 3’ all’estremità dei telomeri contiene un tratto ricco in GT. La telomerasi agisce attraverso 3 passaggi, che costituiscono nell’insieme un ciclo di reazione, in particolare ogni ciclo di reazione aggiunge un’unità ripetitiva al filamento sporgente 3′, inoltre questo ciclo di reazione può essere ripetuto, in modo tale da aggiungere più unità ripetitive. Se andiamo ad analizzare queste tre fasi, vediamo che nella prima fase, chiamata fase di appaiamento, una delle due unità ripetitive della molecola di RNA della telomerasi viene appaiata per complementarietà di basi al filamento 3’ protrusivo. Nella successiva fase di sintesi vengono aggiunti diversi nucleotidi utilizzando come stampo la seconda unità ripetitiva della telomerasi, che porta all’aggiunta di un’unità ripetitiva sull’estremità 3′ protrusiva del cromosoma. A questo punto è stato terminato un primo ciclo di reazione, per aggiungere un’altra unità ripetitiva, la telomerasi si stacca e si va a riappaiare più a valle, in particolare all’ultima unità ripetitiva che è stata aggiunta, e questa è definita come fase di traslocazione. Ripetendo ciclicamente queste tre fasi vengono perciò aggiunte progressivamente unità ripetitive al filamento a singola catena che termina al 3’. In questo modo viene perciò allungato il filamento spaiato, attraverso il meccanismo convenzionale di replicazione del DNA, con il filamento appena allungato che farà da stampo. Al termine di questo processo l’estremità telomerica deve essere sempre lasciata con il 3′ spaiato, ovvero con l’estremità 3′-protrusiva, non sappiamo però attraverso quali meccanismi ciò accada.

Per quanto riguarda la FUNZIONE STABILIZZANTE DEI TELOMERI, sono state formulate tre ipotesi riguardo a come venga assicurata questa funzione, in particolare saltiamo le prime due, perché ormai sono teorie sorpassate e consideriamo solamente la terza, oggigiorno considerata veritiera e in parte anche dimostrata. Tutte le eventualità che accadrebbero se mancassero queste estremità, già citate in precedenza, vengono impedite mettendo in qualche modo al riparo le estremità dei telomeri, in particolare l’estremità spaiata al 3’. In particolare possiamo osservare come si verifichi un ripiegamento dell’estremità telomerica, che va a formare un’ansa, detta ansa T o “T loop”. Ricordiamo infatti che i telomeri hanno una sequenza ripetitiva, e che globalmente questa sequenza varia in lunghezza dalle 5 alle 20 kilobasi, ciò significa che per tutta questa lunghezza è sempre ripetuta la stessa unità ripetitiva. Naturalmente, sul filamento protrusivo terminante al 3′ avremo sequenze ricche in GT, mentre su quello terminante al 5′ avremo sequenze ricche in CA. Quando il telomero si ripiega, l’unità ripetitiva che si trova nel tratto spaiato al 3′, quindi ricca in GT, va a contattare una qualsiasi unità ripetitiva che si trova a monte all’interno della regione telomerica, incontrando il filamento che gli è complementare, andando a scansare il filamento che gli è identico, come accade in pratica nei primi passaggi della ricombinazione omologa. Con questo spiazzamento, si viene a formare una piccola ansa, e si ha l’appaiamento dei due filamenti che abbiamo citato in precedenza. A questo punto termina l’analogia con la ricombinazione omologa, il fenomeno si arresta e il telomero rimane in questa configurazione. Questo fenomeno però non è spontaneo, viene infatti mediato da una proteina che si chiama TRF2, la quale rimane legata all’incrocio dei due filamenti di DNA che si è creato in seguito alla formazione dell’ansa T, in pratica favorendo il processo di invasione del filamento. Un’altra proteina che partecipa a questo processo si chiama TRF1, e favorisce il ripiegamento dell’estremità telomerica.

L’attività telomerasica interviene dunque in definitiva a contrastare la tendenza all’accorciamento dei telomeri durante la replicazione del DNA, per questo motivo, le telomerasi non si trovano in qualsiasi cellula: sono infatti assenti nelle cellule quiescenti o terminalmente differenziate, ossia in cellule non caratterizzate da attività proliferativa. Al contrario, le telomerasi sono ben rappresentate nelle cellule che proliferano attivamente, tipo le cellule staminali embrionali o le cellule staminali adulte. Inoltre, possiamo dire che l’attività telomerasica è coinvolta in processi quali la senescenza (ovvero l’invecchiamento cellulare) e l’immortalizzazione (ad esempio nella trasformazione tumorale). Più precisamente, lo stato di senescenza è connesso a un calo, un declino dell’attività telomerasica (ad esempio nelle cellule che sono destinate ad andare incontro all’apoptosi), mentre l’immortalizzazione è collegata a un aumento, a un’attivazione dell’attività telomerasica, e quest’ultimo caso può ad esempio dare origine alle cellule tumorali.