Citochine proinfiammatorie

Le citochine proinfiammatorie sono la prima classe di citochine, cioè quella che media la risposta naturale o aspecifica del sistema immunitario.

Attraverso la reazione di Schwartzman andiamo ad effettuare un esperimento che ha permesso di capire cosa significhi effettivamente stimolare la produzione di citochine in un organismo vivente, e cosa succede in una patologia grave come può essere la sepsi, un’invasione batterica massiccia. Questo è stato un esempio importante dell’utilizzo del metodo scientifico, cioè vediamo come la dimostrazione di quello che vedo è veramente responsabile degli effetti biologici che ho preso in considerazione.

Schwartzman partì da un insieme di fosfolipidi di membrana e proteine, formanti un lipopolisaccaride acido indicato come LPS, ottenuto dalle pareti batteriche di batteri Gram negativi (ad esempio gli Escherichia Coli). La LPS rappresenta un enorme stimolo antigenico, cioè va a stimolare il sistema immunitario dell’organismo ricevente. Schwartzman prese dei conigli e iniettò loro LPS secondo due diverse modalità, infatti in una famiglia fece una prima iniezione endovena di LPS seguita da una seconda iniezione sempre endovena, il cosiddetto “richiamo”, dopo 24 ore. La prima iniezione non aveva provocato niente, mentre la seconda iniezione provoca una tossicità acuta che mima la sepsi e porta alla morte dell’animale. In una seconda famiglia di conigli invece viene effettuata una prima iniezione di LPS nel sottocutaneo, seguita da un richiamo endovena dopo 24 ore. In questo caso il coniglio sopravvive ma si ha una necrosi localizzata, cioè una zona ben precisa di tessuto in cui si ha avuto la necrosi, viene in questo caso riprodotto in piccolo quello che prima era avvenuto in grande. Per quanto riguarda il coniglio che presenta la necrosi localizzata, vediamo che in questo caso anche se sono presenti degli importanti danni tissutali, le infiammazioni localizzate sono controllabili e anche riparabili. In una zona infiammata si osservano solitamente macrofagi, granulociti neutrofili e monociti, cellule caratterizzate da fagocitosi e dalla produzione di citochine, quindi localmente aumenta la concentrazione di queste citochine, ma rimangono localizzate nella zona infiammata. Di conseguenza possiamo dire che quando si ha un’infiammazione localizzata, le citochine distruggono il tessuto localmente e poi si ha la ricostruzione del tessuto. Nel primo caso gli animali morivano sia per tossicità epatica (si ha una regione di necrosi con produzione di proteine della fase acuta, tra cui citiamo il fibrinogeno e l’amiloide, invece le transaminasi non sono nemmeno attivate, in quanto ci troviamo in una fase di tossicità acuta del fegato) e per una complicanza molto grave che si chiama CID, o anche coaugulazione intravasale disseminata, che porta ad una coaugulazione del sangue all’interno dei vasi. Ora Schwartzman si chiese che cosa causasse questa condizione grave nel coniglio, e attraverso l’utilizzo di anticorpi monoclonali con il test ELISA, andò a cercare qulle citochine che alla fine degli anni ’80 si erano già caratterizzate. Questo test si basa sul fatto che in piccole piastre (o pozzetti) andiamo a porre i nostri anticorpi monoclonali (marcati con un fluorocromo), poi preso il siero di questo animale vado a vedere, una volta posto nel pozzetto, se c’è una reazione che combina la citochina presente nel siero con il mio anticorpo specifico: questo mi permise di evidenziare sia la presenza di queste citochine che la loro quantità espressa in concentrazione. In condizioni normali se faccio questo dosaggio non vedo nulla, il dosaggio è pari a zero perché queste citochine non sono circolanti, infatti si muovono solo in seguito ad un’infiammazione grave, ed anche se l’infiammazione è localizzata in un certo distretto di solito tutto avviene localmente, quindi non aumentano i livelli sierici di queste citochine.

Schwartzman a questo punto dosò (rappresenta il calcolo della concentrazione sierica di queste proteine) la quantità di LPS all’istante zero, e vide che dopo qualche ora nel siero si muovevano diversi tipi di citochine che diventano dosabili. La prima è TNF (Tumor Necrosis Factor), che compare dopo circa un ora, poi dopo un’altra ora c’è un’elevata concentrazione d’interleuchina 1 (IL1), a 3,5 ore dopo l’iniezione di LPS abbiamo un picco di concentrazione dell’interleuchina 6 (IL6) e per finire abbiamo anche un picco d’interleuchina 8. Nel grafico osserviamo che c’è una cascata di segnali, cioè ad un livello elevato di una citochina, ne segue un altro che decresce a sua volta. Poi ne segue un’altra e un’altra ancora fino a IL8, sempre a concentrazioni più basse. In questo tipo di esperimento vediamo come la regolazione delle citochine avviene in particolare a livello trascrizionale, ovvero la trascrizione del TNF favorisce la trascrizione di IL1, che favorisce la trascrizione di IL6 che a sua volta favorisce la trascrizione di IL8. Questo primo esperimento, però, non mi dice nulla sul perché i conigli siamo morti o abbiano avuto un’infiammazione localizzata. Nel secondo esperimento si inietta (al posto di LPS) direttamente TNF e succede esattamente la stessa cosa, ovvero inizialmente si hanno alti livelli di TNF seguiti poi dalla stessa cascata di citochine: questo esperimento permette di dire che sono queste citochine a dare questo quadro clinico nell’animale. Però non è sufficiente, infatti per esserne sicuri è necessario fare un terzo esperimento in cui si usano anticorpi specializzati, si inietta infatti il TNF e contemporaneamente un anticorpo che neutralizzi l’azione del TNF stesso: in questo caso i conigli sopravvivono per il 60 %, ma non per il 100 % perché non è così efficiente l’anticorpo nel bloccare tutti i TNF in circolo. In questo modo è stato dimostrato che ciò che determina un quadro così grave sono queste citochine che vengono chiamate proinfiammatorie, perchè determinano una risposta esagerata di tipo infiammatorio.

Se andiamo ad analizzare le citochine proinfiammatorie studiate adesso in questo tipo di esperimento, vediamo come il TNF è una piccola molecola prodotta dai fagociti mononucleati (monociti, magrofagi o granulociti) e anche dai linfociti. Le “cellule target”, cioè le cellule che espongono il recettore per il TNF, sono invece i granulociti neutrofili, le cellule endoteliali, le cellule nervose dell’ipotalamo, il fegato, il muscolo e il tessuto adiposo. Da un punto di vista degli effetti il TNF porta all’attivazione dei granulociti neutrofili che si mettono a produrre citochine, cercando di rispondere all’infiammazione, permettono anche l’attivazione delle cellule endoteliali che cominciano a secernere fattori di coaugulazione, questo infatti provoca una coaugulazione intravasale disseminata, cioè il sangue coagula mentre circola. Abbiamo anche una stimolazione del centro di termoregolazione dell’ipotalamo che provoca un aumento della temperatura corporea (se aumenta oltre i 41°C si ha la distruzione cellulare a livello della membrana plasmatica che diventa troppo fluida), mentre si ha anche necrosi acuta del fegato, cioè una distruzione del tessuto epatico che porta il fegato a produrre le proteine di fase acuta (tipo l’amiloide o il fibrinogeno), mentre le transaminasi non fanno neanche in tempo ad essere liberate. Infine il tessuto muscolare e quello adiposo vanno in contro a catabolismo, si distruggono. Questo porta alla cachessia, indice di una tendenza catabolica per recuperare energia che porta a diventare “pelle e ossa”. Superata la soglia della cachessia, abbiamo una fase irreversibile che porta alla morte, infatti ai pazienti a questo livello si da un carico di 1500 calorie al giorno per endovena rallentando la distruzione dei tessuti, ma si arriva comunque alla morte. Se andiamo ad analizzare la famiglia del TNF, vediamo come il TNF-β ha attività molto meno rilevanti del TNF-α. In particolare vediamo come il TNF è riconosciuto dal recettore (Tumor Necrosis Factor Receptor) che ha nel dominio intracitoplasmatico il death domain (dominio di morte), che è un dominio di interazione con altre proteine chiamate interattori endocellulari, che può causare l’attivazione dell’apoptosi o della sopravvivenza. In particolare l’interattore primario è TRADD che può legarsi a FADD oppure a TRAF2. Se l’interattore è FADD, si ha l’attivazione dell’apoptosi, mentre se l’interattore è TRAF2, questo va ad inibire l’inibitore del fattore trascrizionale NF-KB, con quest’ultimo che permette la sopravvivenza cellulare. La variante fondamentale è la concentrazione degli interattori interni, infatti se ad esempio una cellula non esprime FADD non ha problemi di morte cellulare, se invece una cellula non esprime più TRAF2, si ha la morte cellulare.

Il picco di TNF è seguito da quello dell’INTERLEUCHINA-1, prodotta sempre dai fagociti mononucleati. Anche in questo caso queste citochine agiscono con un meccanismo cooperativo e sinergico, infatti aggravano o potenziano un determinato effetto biologico, che in questo caso è uguale a quello prodotto dal TNF, dunque abbiamo degli effetti sulle cellule endoteliali, sull’ipotalamo, sul fegato, sul tessuto adiposo e c’è anche un effetto blando di stimolazione delle cellule del timo, dunque possiamo dire che in questo caso abbiamo aggravato tutte le situazioni originate dal TNF.

Segue un picco di concentrazione di INTERLEUCHINA-6, prodotta dai fagociti mononucleati, dalle cellule endoteliali e dai linfociti T. Essa agisce sul fegato, aggravando ulteriormente la tossicità epatica, va a stimolare i timociti, inoltre permette la proliferazione dei plasmoblasti, i precursori delle plasmacellule, e il loro differenziamento. È un azione che a causa della sua concentrazione è ancora più blanda, ma in sintesi possiamo dire che non fa altro che aggravare la situazione.

Per quanto riguarda l’effetto della INTERLEUCHINA 8, vediamo come essa fa parte della famiglia delle chemochine, piccole proteine prodotte da fagociti mononucleati, cellule endoteliali e fibroblasti, che determinano l’effetto biologico della chemiotassi, dell’adesione e dell’attivazione cellulare, vanno infatti a richiamare nelle zone di infiammazione tutti i fagociti mononucleati, andandone ad attivare la loro funzione, in modo da risolvere la situazione d’infiammazione stessa. Le concentrazioni però di IL8 a livello sierico non sono mai elevate, a meno che non sia presente un indice di reale tossicità. Abbiamo detto che questa molecola fa parte della famiglia delle chemochine, di cui questa IL8 ne rappresenta il prototipo, e le funzioni sono essenzialmente le stesse per tutte queste tipi di molecole. I loro recettori si caratterizzano per il motivo aminoacidico caratteristico del recettore, di cui l’unico importante che dobbiamo sapere è il CXCR4 (presente sui granulociti neutrofili, sui linfociti T, sulle cellule NK e su altre cellule ad attività fagocitaria), perchè il suo ligando è SDF1, uno dei più potenti fattori chemotattici (importante soprattutto nel processo di occupazione delle nicchie staminali emopoietiche, che permette alle cellule tumorali di scalzare dalla loro nicchia le cellule sane del sangue, ma in generale è importante nei fenomeni di chemiotassi cellulare), ma anche il virus dell’HIV è un suo ligando (l’altro recettore dell’HIV è il CD4, presente sui linfociti T helper).

Schwartzman aveva individuato solo queste citochine, ma ce ne sono diverse altre, ad esempio gli INTERFERONI, una miscela di piccole proteine distinte in α-interferoni (INF-α), prodotti da tutti i tipi cellulari, e β-interferoni (INF-β), prodotti dai fibroblasti. In terapia si usa una miscela di INF-α, che comprende circa 20 proteine, esse vanno infatti a combattere le infezioni virali, aumentando l’espressione delle molecole di istocompatibilità di classe A, le quali attraverso un particolare meccanismo vanno a migliorare la ricezione dei peptidi virali, dove verranno riconosciuti, dal recettore dei linfociti T (T cell receptor). In particolare gli interferoni sono usati in alcune malattie neoplastiche e nelle epatiti, sono però un farmaco molto costoso e dunque sono poco utilizzati.

Esistono anche l’INTERLEUCHINA 15 e l’INTERLEUCHINA 12 che prodotte sempre essenzialmente da fagociti mononucleati e linfociti, determinano una stimolazione dei linfociti T e delle cellule NK (natural killer), inoltre IL-12 favorisce anche la liberazione dell’interferone γ in seguito ad infezione virale.

L’INTERLEUCHINA 10 invece è prodotta fagociti e cellule mononucleate (in piccola parte può essere prodotta anche dai linfociti), ed è l’unica citochina ad aver carattere inibitorio, infatti utilizzando la via JAK/STAT inibisce la proliferazione dei fagociti mononucleati e quindi la loro attività nelle zone d’infiammazione.

Sulla situazione vista in precedenza sono stati usati diversi metodi per cercare di combattere questo tipo di meccanismi di attivazione delle citochine, ad esempio la Talidomide negli anni ’50 e ’60 era un farmaco utilizzatissimo, esso era un neurolettico (sedativo per il sistema nervoso) usato al posto dei barbiturici, ma dopo alcuni anni questa sostanza si dimostrò essere molto dannosa per cui nascevano bambini con malformazioni gravissime come la focomelia (mancanza degli arti superiori), quindi è stata eliminata dal commercio. È stata ripresa qualche anno fa perché si è visto che ha un’azione inibente sulla trascrizione delle citochine che sono state prodotte in elevate concentrazioni nell’esperimento di Schwartzman, in particolare al giorno d’oggi viene utilizzata nel plasmocitoma, una situazione di tumore delle plasmacellule, che permette di andare a bloccare le cascate delle citochine proinfiammatorie, impedendone la trascrizione, che sappiamo essere un importante mezzo di differenziamento di queste cellule, e dunque di rendere queste plasmacellule meno aggressive.

Generalizzando dunque le attività biologiche delle citochine pro-infiammatorie, vediamo come agiscono su tutte le cellule effettrici dell’immunità naturale (o aspecifica), in particolare sui granulociti neutrofili, sui monociti, sui macrofagi, sui granulociti eosinofili, sui linfociti T-helper, sulle cellule NK e sulle plasmacellule. Esse quindi coinvolgono tutta la risposta immunitaria, quella generica (immunità naturale) in un primo intervento funzionale, poi arrivano attraverso la produzione di linfociti e granulociti eosinofili ad attivare anche l’immunità specifica mediata dai linfociti.